基于AAV条形码测序技术高通量筛选心脏特异性启动子优化基因治疗策略

本研究针对心脏基因治疗中启动子选择的关键问题，通过创新性应用AAV barcode-seq技术，系统评估了六种心脏特异性启动子（包括cTnT、NCX等）在多种模型中的表达特性。研究人员采用AAV2/6/9三种衣壳包装启动子工具包，在hiPSC-CMs、NRVMs等体外模型及小鼠、猪等四种动物模型中开展平行比较，发现cTnT启动子兼具高效心脏表达与低肝脏泄漏特性。该研究为优化AAV载体设计提供了重要技术平台，对提高心脏基因治疗的安全性和有效性具有重要指导意义。

心脏基因治疗领域长期面临着一个关键瓶颈：如何实现治疗基因在心肌细胞的高效特异性表达？尽管腺相关病毒(AAV)载体已成为基因递送的主力军，但临床转化效果却不尽如人意。究其原因，除了衣壳的组织靶向性外，表达盒设计中的启动子选择同样至关重要。目前超过50%的临床试验仍采用泛组织表达的CMV启动子，这种"一刀切"的策略往往导致肝脏等非靶组织的基因泄漏表达，可能引发免疫毒性等问题。虽然已有研究尝试比较不同启动子的性能，但传统方法每次只能测试单个载体，效率低下且难以实现多模型平行比较。

来自澳大利亚Westmead研究所等机构的研究团队在《Gene Therapy》发表了一项突破性研究，首次将AAV barcode-seq技术应用于心脏启动子的高通量筛选。这项研究创新性地构建了包含六种心脏特异性启动子（心肌肌钙蛋白T(cTnT)、钠钙交换体(NCX)、α-肌球蛋白重链(aMHC)等）的AAV工具包，每种启动子驱动GFP表达并携带独特条形码，使得所有载体可以混合后同时转导细胞，通过测序解码各启动子的相对活性。研究人员在hiPSC来源心肌细胞(hiPSC-CMs)、新生大鼠心室肌细胞(NRVMs)等体外模型，以及小鼠、大鼠、绵羊和猪四种动物模型中系统评估了这些启动子的性能，发现cTnT在保持心脏高表达的同时肝脏泄漏最低，是理想的候选启动子。

研究团队采用了多项关键技术：1）构建含18种独特条形码的AAV载体库，实现启动子性能的平行比较；2）应用Snakemake生物信息学流程处理NGS数据，通过表达指数(Expression Index, EI)量化启动子效率；3）多物种验证策略，涵盖hiPSC-CMs、NRVMs等细胞模型及小鼠至猪的进化跨度；4）创新性采用导管介导的心肌内注射实现大动物心脏靶向递送。这些方法共同构成了一个完整的评估体系。

【NCX和cTnT在心肌细胞富集培养模型中表现最佳】体外实验显示，在hiPSC-CMs和NRVMs中，NCX和cTnT的转导效率显著高于其他心脏启动子，仅次于泛组织表达的CMV。值得注意的是，cTnT在肝癌细胞系HuH7中几乎无表达，验证了其严格的心脏特异性。

【cTnT在小动物模型中展现心脏偏好性】小鼠和大鼠实验揭示了一个有趣现象：虽然aMHC在心脏表达最强，但在肝脏也有明显泄漏；而cTnT在保持较高心脏表达(EI>0.4)的同时，肝脏活性显著降低。这种"高心脏、低肝脏"的表达谱使其成为系统给药策略的理想选择。

【大动物模型验证cTnT卓越性能】在更具临床相关性的猪和绵羊模型中，cTnT的表现尤为突出。通过NOGA导管系统实现心肌精准注射后，cTnT驱动的表达水平仅次于CMV，且显著高于其他组织特异性启动子，这一发现在两种衣壳(AAV6和AAV9)中均得到重复。

研究结论部分强调，这项研究建立了首个基于NGS的心脏启动子高通量筛选平台，其创新性体现在三个方面：首先，条形码技术实现了多启动子的平行比较，将传统数周的工作压缩至单次实验；其次，跨物种验证策略揭示了启动子性能的保守性与差异性，如aMHC在啮齿类表现优异但在大动物中稍逊；最重要的是，发现cTnT启动子兼具高效性与特异性，其-375至+43区域已证实含有足够的心肌特异性调控元件。这些发现为临床级AAV载体的设计提供了重要依据，特别是针对需要长期表达的遗传性心脏病治疗。

讨论部分深入分析了该技术的转化价值：与目前处于II期临床试验的AAV2i8衣壳改造策略相比，cTnT启动子的应用提供了另一种降低肝脏毒性的思路；结合近期报道的miRNA脱靶技术，可望实现"双保险"的特异性调控。研究人员也指出，未来需要进一步评估cTnT在人类肝脏模型中的泄漏情况，并探索其与新型合成启动子（如SPc5-12）的组合效果。这项研究不仅为心脏基因治疗提供了优选启动子，更重要的是建立了一个可扩展的技术平台，可用于评估其他组织特异性调控元件，推动精准基因治疗的发展。