靶向小细胞外囊泡中网状蛋白4(RTN4)抑制三阴性乳腺癌转移并增强免疫治疗效果的机制研究

本文推荐：该研究首次揭示了三阴性乳腺癌(TNBC)患者血浆中小细胞外囊泡(sEV)携带的网状蛋白4(RTN4)通过激活NF-κB信号通路促进上皮-间质转化(EMT)和PD-L1表达，进而驱动肿瘤转移并形成免疫抑制微环境。创新性采用单颗粒分辨率纳米流式(NanoFCM)技术表征RTN4空间分布，证实靶向RTN4联合PD-1抑制剂可显著抑制肿瘤生长并增强CD8+T细胞浸润，为TNBC诊疗提供新型液体活检标志物和联合治疗策略。

ABSTRACT

研究团队通过分离非转移性和转移性三阴性乳腺癌(TNBC)患者血浆中的小细胞外囊泡(sEV)，发现转移组sEV中网状蛋白4(RTN4)表达显著升高。临床数据分析显示RTN4与晚期TNBC患者不良预后相关。体内外实验证实，相比RTN4^Low sEV，RTN4^high sEV能显著促进肿瘤细胞迁移、侵袭、上皮-间质转化(EMT)和肺转移，同时上调PD-L1表达并抑制CD8⁺T细胞浸润。机制研究表明sEV-RTN4通过激活NF-κB信号通路驱动EMT和PD-L1表达。抗PD-1与抗RTN4联合治疗在抑制肿瘤转移和促进免疫浸润方面显著优于单药治疗。

1 Introduction

TNBC作为缺乏ER/PR/HER2表达的乳腺癌亚型，具有高度异质性和转移倾向。尽管免疫检查点阻断(ICB)疗法取得进展，但部分患者仍存在治疗抵抗。sEV作为30-150nm的天然囊泡，在肿瘤微环境调控中发挥关键作用。既往研究发现RTN4在胶质瘤、肝癌等肿瘤中异常表达，但其在TNBC中的功能尚未阐明。

2 Methods

研究收集2018-2019年瑞金医院TNBC患者血浆样本，通过尺寸排阻色谱法分离sEV。采用冷冻电镜(Cryo-TEM)和纳米流式(NanoFCM)表征囊泡特征，4D标记定量蛋白质组学筛选差异蛋白。建立4T1原位瘤和尾静脉转移模型，通过免疫组化(IHC)、流式细胞术和染色质免疫沉淀(ChIP)等验证机制。患者来源类器官(PDO)用于药物敏感性测试。

3 Results

3.1 M-TNBC sEV促进肿瘤进展

转移性TNBC患者血浆sEV(NM-sEV vs M-sEV)显著增强MDA-MB-231细胞迁移侵袭能力(Transwell实验显示增加2.1倍)。小鼠模型中，M-sEV处理组肺转移结节数增加3.5倍，肿瘤重量增加2.3倍，伴随E-cadherin下调(0.4倍)和Vimentin上调(2.8倍)。

3.2 RTN4的临床意义

蛋白质组学筛选出17个上调蛋白，其中RTN4在转移组sEV中表达升高4.2倍。组织芯片分析显示RTN4高表达患者5年生存率降低42%，且与CD8⁺T细胞减少(r=-0.67)和PD-L1升高(r=0.73)显著相关。

3.3 RTN4的功能机制

shRNA敲低RTN4后，sEV促转移效应减弱60%。RNA-seq揭示NF-κB通路关键基因(如RelA、IκBα)表达改变。PDTC抑制剂处理可逆转RTN4^high sEV诱导的EMT标志物变化，荧光素酶报告实验证实p65直接调控PD-L1启动子活性。

3.4 联合治疗价值

抗RTN4联合抗PD-1使小鼠肿瘤体积缩小68%，肺转移减少82%。PDO模型显示联合组CD8⁺T细胞浸润增加3.1倍，E-cadherin表达恢复至对照组的1.8倍。纳米流式动态监测显示抗RTN4治疗7天后血浆sEV-RTN4水平下降54%。

4 Discussion

该研究创新性地将单颗粒检测技术应用于sEV膜蛋白分析，阐明RTN4通过NF-κB/PD-L1轴驱动免疫逃逸的新机制。提出的"液体活检+免疫联合"策略为TNBC精准诊疗提供新思路，但sEV-RTN4的具体分泌调控机制仍需进一步探索。

Author Contributions

王涵与黄仁宏为共同第一作者，沈坤炜教授团队主导完成从临床样本收集到机制研究的全流程工作，王正博士负责纳米流式技术指导。研究获得国家自然科学基金等项目支持。