利用MBNL依赖性可变剪接外显子调控强直性肌营养不良基因治疗的新策略

这篇综述创新性地提出利用肌肉盲样蛋白（MBNL）依赖性可变剪接外显子（DMXon）构建腺相关病毒（AAV）兼容调控元件，通过响应疾病相关RNA毒性水平动态调节MBNL1治疗蛋白表达。研究在强直性肌营养不良1型（DM1）细胞和小鼠模型中验证了该系统的双重功能：在骨骼肌改善肌强直症状的同时，通过负反馈机制预防心脏毒性，为多系统受累疾病的精准基因治疗提供了新思路。

研究背景与科学问题

强直性肌营养不良1型（DM1）是由DMPK基因3'非翻译区CTG重复扩增引起的多系统疾病，其核心病理机制为异常CUG重复RNA通过 sequestration（隔离）肌肉盲样蛋白（MBNL）导致剪接紊乱。虽然病毒载体基因治疗在神经肌肉疾病中取得突破，但DM1的临床异质性和MBNL过表达的心脏毒性制约了治疗窗口。本研究旨在开发响应MBNL活性的自调控基因元件DMX^on，实现疾病严重程度依赖的治疗输出。

技术路线与创新设计

研究团队从7个MBNL依赖性剪接事件中筛选出动态范围最大的LDB3外显子8、MBNL1外显子5和NFIX外显子7，通过插入Kozak序列改造为翻译调控元件。在四环素诱导的HA-MBNL1 HEK293细胞模型中，原始版本显示剂量依赖性外显子跳跃（ΔPSI达50%）。通过截短内含子区域优化后，获得高灵敏度（DMX^on-Lo）和高阈值（DMX^on-Hi）两个版本，其中DMX^on-Lo-V2通过删除18bp内含子沉默子区域（Del2突变）维持了动态范围。

动物模型验证

在表达220个CTG重复的HSA^LR转基因小鼠中，肌肉特异性CK8启动子驱动的AAV9载体表现出组织特异性调控：

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  骨骼肌响应：DMX^on-Hi-V2在股四头肌显示27%的ΔPSI，显著改善肌强直（EMG放电减少60%）和Clcn1外显子7剪接异常

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  心脏保护：全身递送后，DMX^on-Lo-V2.MBNL1组小鼠左室射血分数保持55±3%，而组成型表达组4周内全部死亡

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  剂量效应：DMX^on-Hi需要更高MBNL浓度激活（EC₅₀=4.2 ng/ml），适合严重表型矫正；DMX^on-Lo则对低MBNL敏感（EC₅₀=1.1 ng/ml）

人类细胞模型强化证据

利用先天性DM1患者iPSC来源的肌管（1700 CTG重复），DMX^on-Lo展现出更显著的调控能力：患者细胞外显子包含率达64%，经MBNL1治疗后降至23%，而同源对照仅8%。长读长测序证实polyA信号插入成功消除了毒性RNA核灶。

临床转化价值与局限

该研究首次实现：

1. 1.

   利用内源性剪接网络构建闭环调控系统

2. 2.

   通过不同EC₅₀元件匹配疾病严重程度

3. 3.

   在AAV载体中保留<1kb的紧凑结构

当前局限在于HSA^LR模型骨骼肌响应较弱（ΔPSI<15%），未来需在MBNL1敲除等严重模型中测试。该策略可扩展至其他RNA毒性疾病，为动态调控的基因治疗提供范式。