无偏倚细胞培养筛选鉴定DNA适体作为新型衰老细胞特异性试剂

时间：2025年9月21日

来源：Aging Cell

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本综述系统阐述了通过无偏倚细胞培养筛选（SELEX）技术，从万亿级随机DNA库中鉴定出特异性靶向衰老细胞的DNA适体。研究证实适体可特异性识别小鼠衰老细胞（而非人类细胞），并首次发现其靶点为纤连蛋白（fibronectin）的特殊形式（含EDA结构域）。该适体在自然衰老小鼠组织中染色增强，而在清除p16INK4a阳性细胞后染色减弱，为衰老细胞检测提供了新型分子工具，对衰老机制研究和抗衰老药物（如senolytics）开发具有重要价值。

2 结果

2.1 适体筛选

研究团队从成年C57BL6/J小鼠分离原代小鼠耳部成纤维细胞（MAFs），采用依托泊苷（etoposide）诱导衰老模型。通过细胞形态变化、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增强、细胞周期抑制蛋白（p16、p21）及衰老相关分泌表型（SASP）因子表达上调、增殖标志物Ki67消失等多维度验证衰老表型（图1）。以未处理MAFs作为阴性筛选对照，衰老MAFs作为阳性靶标，进行系统性进化配体指数富集（SELEX）筛选（图2A）。经过9轮筛选，qPCR监测显示第7轮起文库回收率显著提升并持续增强（图2B）。新一代测序分析表明，非唯一序列比例从第5轮开始显著增加，表明衰老细胞特异性DNA分子的富集（图S1C）。最终合成10条80聚体DNA适体候选序列及2条阴性对照序列进行后续验证（表S1）。

2.2 体外衰老细胞结合筛选

通过qPCR和荧光标记技术评估候选适体与衰老/对照MAFs的结合特性。所有候选适体（除6764外）均显示对衰老细胞的显著优先结合（图3A-C，表S2）。为排除培养时间差异的干扰，实验设置血清饥饿减缓对照细胞增殖，结果显示7种适体保持显著特异性结合（图S2A）。而经胰蛋白酶处理重铺的衰老细胞仅2种适体保持结合，表明适体靶标可能为对蛋白酶敏感或细胞重铺时丢失的膜表面蛋白（图S2B）。

研究进一步通过X射线辐射和过氧化氢诱导衰老模型验证适体普适性。两种模型均成功诱导衰老标志物表达（图S3、S5），除6764外所有适体均显示特异性结合（图S4、S6）。跨细胞类型验证显示，5种适体可特异性结合衰老的小鼠C2C12成肌细胞（图S7-S8）和AML12肝细胞（图S9-S10），但无一适体结合衰老的人正常肺成纤维细胞（NHLF）或IMR90细胞（图S11-S13），表明所选适体具有物种特异性（鼠源偏好）。

3 结合靶标鉴定与表征

采用SILAC（稳定同位素标记氨基酸细胞培养）蛋白质组学技术鉴定适体6756和6762的分子靶标。实验通过甲醛交联将生物素化适体与同位素标记细胞的潜在靶蛋白结合，经链霉亲和素磁珠富集、交联逆转和LC-MS/MS分析，发现唯一显著富集的蛋白为纤连蛋白（fibronectin）（表1）。Western blot验证证实6756和6762可特异性富集纤连蛋白，而阴性对照6766或单纯磁珠无此效果（图4A、S14）。直接使用纯化小鼠纤连蛋白进行结合实验，再次证实6756和6762的直接捕获能力（图4B）。

生物层干涉技术（BLI）测定显示适体6756和6762与纤连蛋白的解离常数（K_D）分别为921 pM和579 pM，而对照6766无结合活性（图4C）。在DMEM+10% FBS复杂环境中，6762仍保持特异性结合。共聚焦显微镜观察发现适体与抗纤连蛋白抗体的染色模式存在差异，提示适体可能识别纤连蛋白的特殊形式（图S15）。进一步研究发现衰老MAFs中总纤连蛋白蛋白水平升高（图S16C-D），但总Fn1 mRNA无显著变化，而含额外结构域A（EDA）的转录本显著上调（图S18）。LC-MS/MS检测到EDA特有肽段（图S17），支持适体可能特异性识别FN1-EDA异构体的假设。

4 适体染色与体内衰老负荷的相关性

为评估适体在体内的应用潜力，研究检测了适体6762对自然衰老小鼠肺组织的染色情况。结果显示，年轻小鼠无显著染色，而22和30月龄小鼠组织中出现广泛且强烈的特异性染色，阴性对照6766则无此效果（图5、S19）。这种年龄相关性染色与已知的衰老细胞累积规律一致。

进一步利用INK-ATTAC转基因小鼠模型（可诱导清除p16^INK4a阳性细胞）进行验证。AP（AP20187）处理组相比vehicle对照组，6762染色强度显著降低，而常规抗纤连蛋白抗体染色无变化（图6、S20-S21）。高分辨率图像显示两者染色模式并不重叠（图S22）。天狼星红（PSR）染色显示AP处理减少肺组织胶原沉积（图S23），表明衰老细胞清除改善细胞外基质（ECM）病理改变。在p16Cre; Ai14报告基因小鼠中，6762染色范围远超tdTomato标记的p16阳性细胞区域（图S24），提示适体可能识别更广泛的衰老相关微环境改变（如ECM重塑）。

5 讨论

本研究成功通过无偏倚细胞筛选获得一系列具有衰老细胞特异性的DNA适体，其特异性跨越多种细胞类型（成纤维细胞、成肌细胞、肝细胞）和衰老诱导方式（依托泊苷、X射线、过氧化氢）。适体显示对鼠源衰老细胞的偏好性，其靶标被鉴定为纤连蛋白，可能通过识别含EDA结构域的特殊形式（FN1-EDA）实现特异性结合。这种识别特性与常规抗体不同，可能反映衰老相关蛋白构象变化或翻译后修饰。

纤连蛋白在衰老中的作用复杂且存在争议：一方面FN1-EDA在动脉粥样硬化等病理中促进疾病进展（Doddapattar et al. 2020），另一方面某些纤维连接蛋白亚型（如FNDC5）对抗衰老具有保护作用（Cardoso et al. 2018）。本研究数据显示适体识别可能特异性针对衰老相关纤连蛋白变体，而非总纤连蛋白 pool。

适体6762在老年组织中的广泛染色提示衰老相关ECM改变可能远超实际衰老细胞数量，反映了SASP介导的旁分泌信号对微环境的深远影响。未来筛选可考虑纳入更多细胞类型、交替使用不同衰老诱导方式、关注适体内化能力，以提升跨物种普适性和体内应用潜力。这类适体有望发展为衰老特异性诊断工具、预后标志物或靶向递送系统（如适体-药物偶联物），提高抗衰老药物（senolytics/senomorphics）的选择性和疗效。