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本文推荐一项创新性研究：通过诱导早衰蛋白（progerin）表达成功构建人小胶质细胞衰老模型（HMC3-Progerin），该模型呈现DNA损伤增加、衰老相关分泌表型（SASP）激活等典型衰老特征。研究首次揭示衰老小胶质细胞存在核质运输（NCT）功能障碍，导致肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关蛋白FUS发生核质错误定位，同时伴随细胞迁移/吞噬功能下降及应激颗粒（SG）形成异常，为探讨衰老小胶质细胞驱动神经退行性病变提供了全新实验平台和机制见解。
脑衰老是神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症ALS和阿尔茨海默病AD）最重要的风险因素。小胶质细胞作为大脑常驻免疫细胞，在维持脑稳态中发挥核心作用。随着年龄增长，小胶质细胞从神经保护表型向神经毒性表型转变，通过慢性炎症反应促进神经退行进程。尽管理解小胶质细胞衰老至关重要，但目前缺乏可靠的人源体外模型研究这些过程。
生理性衰老的小胶质细胞表现为营养不良形态：过程去分支和缩短、细胞质碎片化，大脑监视能力显著下降。同时，衰老小胶质细胞出现过度激活状态，导致炎症因子分泌增加和吞噬功能改变。与年轻大脑相比，衰老大脑中的小胶质细胞表现出迁移能力降低但炎症持续存在的特点，其他报道的特性包括DNA损伤增加和端粒缩短。
在神经退行性疾病过程中，稳态小胶质细胞从神经保护性抗炎表型转变为疾病相关的促炎表型（疾病相关小胶质细胞DAMs），这可能从根本上推动疾病进展。ALS作为一种运动神经元选择性丢失的神经退行性疾病，其常见突变基因包括FUS（肉瘤融合蛋白）、SOD1（超氧化物歧化酶1）和TARDBP（TAR DNA结合蛋白，TDP-43蛋白）。TDP-43和FUS是RNA和DNA结合蛋白，主要定位于细胞核，但具有核质穿梭能力。FUS在DNA修复和RNA代谢中起关键作用，大多数ALS相关FUS突变破坏其核输入，导致由于C末端核定位序列（NLS）附近突变引起的细胞质错误定位。
近年来，小胶质细胞在ALS中的病理作用日益受到关注。例如，在暴露于过表达野生型FUS的星形胶质细胞条件培养基后，原代小胶质细胞培养物中促炎细胞因子产生增加。表达野生型FUS的小鼠也显示脊髓中小胶质细胞激活。尽管对小胶质细胞参与ALS的认识不断增长，但衰老小胶质细胞在神经退行过程中的具体作用仍未被探索。这一知识空白很可能是由于缺乏合适的模型系统来深入研究这些相互作用。
研究使用人HMC3细胞（ATCC, CRL-3304）在MEM α培养基中培养，补充10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。通过含有（1）GFP-Progerin和（2）rtTA3的慢相关病毒（LAV）转导HMC3细胞，建立多西环素诱导的progerin表达系统。progerin是Lamin A的突变形式，负责 Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS），该遗传性早衰综合征患者表现出加速衰老，使其成为研究衰老过程的合理细胞培养模型。
HMC3细胞系通过SV40依赖性永生化人胎儿脑源性原代小胶质细胞培养物建立。使用先前发布的AgeScore对HMC3-Progerin细胞进行表征，证明多种年龄标志物的显著增加。通过多西环素处理72小时诱导progerin表达，并通过qPCR和Western Blot分析验证progerin在RNA和蛋白水平的表达增加。
研究采用多种实验方法评估细胞衰老表型：免疫荧光染色分析γH2A.X焦点、H3K9三甲基化（H3K9Me3）和核形态；单色多重qPCR（MM-qPCR）测量端粒长度；衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）检测试剂盒评估衰老状态；酶联免疫吸附测定（ELISA）分析IL-6和IL-8分泌；细胞周期分析通过流式细胞术进行；迁移实验使用2孔迁移插入物；吞噬作用实验使用pHrodo Red Zymosan BioParticles；RNA测序分析转录组变化；核质运输功能通过shuttling assay评估。
成功建立可诱导progerin表达TET-ON系统，多西环素诱导后progerin mRNA和蛋白表达显著上调，转导效率达89.42%±3.5。使用AgeScore评估延长progerin表达的影响，该评分包含反映主要（DNA损伤、组蛋白修饰、端粒损耗）和拮抗性（细胞周期停滞、SA-βGal表达、SASP激活、Lamin B1表达、形态变化）衰老标志物的经典年龄标志物。
诱导的HMC3-Progerin细胞在所有三个时间点（3、7和14天）均显示DNA双链断裂（DSBs）显著增加，通过γH2A.X焦点染色量化。H3K9Me3表达水平在所有时间点均降低，通过校正总细胞荧光（CTCF）测量。端粒长度通过单色多重qPCR（MM-qPCR）测量未发生变化。
细胞周期阻滞关键标志物CDKN2A（p16）和CDKN1A（p21）的RNA表达水平未见变化，但SA-βGAL表达在诱导的HMC-Progerin细胞中增加。Lamin B1表达在所有三个时间点均降低，而核大小变化仅在progerin表达14天后观察到。通过测量细胞培养培养基中IL6和IL8分泌评估SASP激活，显示诱导的HMC3-Progerin与未诱导对照细胞相比两种细胞因子均显著增加。总体AgeScore从无progerin表达小胶质细胞的0值增加到诱导HMC3-Progerin细胞3天和7天后的6值以及14天后的7值。
小胶质细胞作为大脑的第一道防线，其核心功能是向感染或破坏位置迁移以及在激活后吞噬细菌、碎片或凋亡细胞。随着衰老进程，小胶质细胞逐渐过度激活并丧失迁移和吞噬能力。
通过qRT-PCR分析多种促炎（TNFalpha、IL6、CXCL10）和抗炎（TGFbeta、ARG1、TREM2）因子在诱导早衰3天后的RNA表达水平。为进一步评估小胶质细胞激活，用10μg/mL LPS处理细胞24小时。在诱导的HMC3-Progerin细胞中，观察到促炎基因TNFalpha和IL6基础表达增加以及抗炎基因TGFbeta和ARG1上调。早衰HMC3-Progerin细胞中仅IL6显著上调。
使用2孔培养插入物通过划痕实验评估小胶质细胞迁移能力。为特异性评估HMC3-Progerin细胞迁移，在移除插入物前用丝裂霉素C处理2小时抑制增殖。移除插入物后，细胞纵向监测48小时，观察到诱导的HMC3-Progerin与未诱导细胞相比迁移显著减少。
使用pHrodo Red Zymosan BioParticles分析吞噬活性，这些颗粒在pH低于5时发出荧光（通常存在于吞噬体内）。与pHrodo颗粒孵育后，量化吞噬细胞百分比，发现诱导细胞与未诱导HMC3-Progerin细胞相比吞噬能力显著下降。progerin表达7天和14天后也观察到吞噬能力下降，同时P2RY12表达水平在诱导的HMC3-Progerin细胞中降低。
通过RNA测序比较未诱导与诱导HMC3-Progerin细胞的基因表达，差异表达基因（DEGs）的主成分分析（PCA）显示未诱导和诱导HMC-Progerin细胞明显分离，PC1占方差的81%，表明progerin表达引起的早衰效应强烈。生物学重复紧密聚类，反映高重复性。
分析小胶质细胞特异性核心基因，发现表征疾病相关小胶质细胞（DAMs）的基因表达变化，特别是在第2阶段。使用"小胶质细胞注释工具"（一种从高维数据集中识别小胶质细胞状态的生物信息学资源）直接比较+Dox与-Dox细胞的DEGs与已建立的参考特征（来自异种移植人小胶质细胞和人死后数据集）。结果显示，在所有DEGs中，62.3%与干扰素相关小胶质细胞重叠，44.6%与炎症性小胶质细胞重叠，40.7%与抗原呈递小胶质细胞重叠，37.4%与疾病相关小胶质细胞重叠，仅31%与稳态小胶质细胞基因重叠。
基因本体（GO）分析揭示与刺激反应（如MMP2、IGFBP5、CLDN1）、对外部刺激反应（如EDNRA、FOXG1、LONP1）、细胞迁移调节（如CD7、NGFR、CCL2）以及细胞通讯调节（如CYP26B1、CD74、CEACAM）相关的RNA表达发生年龄相关变化。与已发表的人衰老数据集比较鉴定出一致失调的CEACAM1和PDPN，两者均涉及衰老和血管或干细胞衰老。通过qPCR验证这些基因并显示显著上调。
研究发现AGE-RAGE轴中起重要作用的基因（COL1A、SERPINE1、F3、AGTR1）失调。晚期糖基化终末产物（AGEs）是在炎症、神经退行性疾病或随着年龄增长更大程度形成的异质性分子群。通过qPCR确认AGTR1以及COL1A的RNA测序结果，并观察到AGEs受体（RAGE）的RNA表达上调。与KEGG通路比较揭示32个核质运输相关（hsa03013）、47个AGE-RAGE通路相关（hsa04933）和45个吞噬作用相关基因（hsa04145）失调，与诱导HMC3-Progerin细胞中观察到的吞噬功能受损一致。此外，检测到CPEB4、EIF2A和ZC3H12A上调，这些是应激颗粒形成的关键调节因子。最后，使用AgeClock MultiTimer分析显示早衰HMC3-Progerin细胞中上调。
为研究小胶质细胞年龄相关表型是否可逆或减弱，首先分析可能抵消观察到的基因表达变化的潜在化合物。通过将DEGs列表与L1000CDS2签名数据库交叉，研究早衰诱导的转录组变化是否可能被FDA批准药物逆转。通过此分析，雷帕霉素作为有希望的候选药物出现。
此外，还评估了达沙替尼和槲皮素的组合，因为这种senolytic鸡尾酒广泛用于靶向衰老细胞和调节衰老通路，提供减轻衰老细胞和分子迹象的潜在方式。用雷帕霉素（500nM）或达沙替尼（200nM）和槲皮素（10μM）组合处理HMC3-Progerin细胞3、7或14天。令人兴奋的是，senolytic治疗能够减弱progerin诱导的AgeScore增加。两种治疗在3天和7天后DNA损伤改善，但H3K9Me3下调未受影响。端粒损耗和细胞周期停滞未见变化。达沙替尼加槲皮素在3天和7天改善SA-βGal和Lamin B1水平，但14天后未改善。两种治疗在14天后核形态恢复，而SASP表型保持不变。达沙替尼加槲皮素在3天后出现AgeScore改善，两种治疗在7天后出现，达沙替尼加槲皮素在14天后略有改善。在对照细胞中，仅IL6水平在雷帕霉素治疗7天后降低。这些发现表明，senolytic治疗能够部分减轻小胶质细胞中年龄相关细胞变化，尽管并非所有衰老特征对干预反应相同。
小胶质细胞衰老本身对脑稳态的作用及其对神经退行性过程的影响广泛未知。由于NCT损伤是衰老的驱动因素并在神经退行性疾病期间经常中断，研究早衰小胶质细胞是否显示NCT受损。
首先通过免疫荧光（IF）分析Ras相关核蛋白（RAN）表达水平。Ran是一种小GTP酶，调节货物在核质之间的运输方向性。与上述KEGG分析中NCT失调一致，发现在HMC3-Progerin细胞中progerin表达7-14天后RAN表达显著下调，这可通过雷帕霉素或达沙替尼+槲皮素组合治疗恢复。
为进一步验证诱导HMC3-Progerin细胞NCT的普遍干扰，通过LAV用含有经典核定位序列（NLS）和核输出信号（NES）的dtTomato报告基因转导它们。结果显示与未诱导HMC3-Progerin细胞相比，诱导细胞中从核到细胞质的重新分布。
由于核蛋白的细胞质错误定位是神经退行性疾病的标志，特别是ALS，对与ALS和其他神经退行性疾病相关的不同RNA结合蛋白（RBPs）进行IF染色，即FUS、EWSR1（Ewing肉瘤断点区域1）和hnRNPA2B1（异质核核糖核蛋白A2/B1）。在此，能够检测到诱导HMC3-Progerin细胞中FUS从核到细胞质的显著错误定位；EWSR1和hnRNPA2B1未受影响。
最后，通过应激颗粒（SGs）形成检查小胶质细胞应激反应，应激颗粒是细胞质RNA颗粒，由RBPs和未翻译mRNAs组成，与细胞应激响应中mRNA的细胞质代谢相关。在正常条件下，SGs是保护细胞免受应激的动态结构，但 prolonged stress导致它们成熟为更稳定的复合物。RBPs的细胞质错误定位通常触发SG形成。最近报道衰老神经元遭受慢性细胞应激，阻止SG形成。因此，评估早衰小胶质细胞中SG形成。为此，将诱导和未诱导HMC3-Progerin细胞与亚砷酸钠（SA）在37°C孵育1小时。处理后，两组均显示SG形成显著增加。然而，值得注意的是，这种反应在早衰小胶质细胞中减弱。
作为大脑的守护者，小胶质细胞在维持健康脑稳态中起至关重要的作用。随着年龄增长，它们改变表型，导致该细胞类型功能受损。衰老小胶质细胞对年龄相关疾病过程以及神经退行性过程的影响仍 largely unexplored。
获得衰老人小胶质细胞的体外培养具有挑战性。虽然来自老年供体的iPSC模型可能看似理想用于研究衰老，但重编程过程通常擦除关键衰老标志物，由此可以观察到供体年龄的弱残留签名。HMC3是人胎儿来源小胶质细胞，已被永生化。Progerin过表达可能提供诱导衰老的机会。HMC3细胞与可诱导progerin系统结合提供了一个有吸引力的模型，它将受控衰老与可扩展性和降低变异性相结合。
Progerin源自核纤维蛋白Lamin A的部分加工形式产生，在HGPS（一种导致早衰的罕见遗传 disorder）中起关键作用。从机制上讲，progerin表达导致细胞核众多形态变化以及DNA复制、有丝分裂中断和异染色质组织改变。值得注意的是，在健康老年供体的成纤维细胞中也鉴定出progerin，导致HGPS样缺陷，包括增加DNA损伤、降低H3K9Me3表达和端粒缩短。在先前研究中，证明在年轻供体成纤维细胞中过表达progerin激活各种年龄标志物，如Lamin B1表达降低、SASP激活和细胞周期停滞启动。此外，抑制老年非HGPS供体中progerin表达增强增殖活性，增加H3K9Me3表达，并减少各种衰老标志物（如IGFBP3、GADD45B）。这些发现表明progerin依赖性机制类似于正常衰老。虽然Lamin A突变不能完全代表所有衰老过程，但我们的模型为研究人小胶质细胞衰老提供了新途径。
HMC3小胶质细胞中可诱导progerin表达增加AgeScore，这是将常见衰老标志物组合成单一值的综合测量。AgeScore的开发旨在提供定量和比较工具以测量定义条件下的衰老相关细胞响应，包括但不限于小胶质细胞和/或progerin表达，并包含几个年龄标志物以更广泛描述衰老过程。虽然可以在AgeScore内对单个项目加权，但它并非没有偏差，因为每个标志物的影响可能因细胞类型和条件而异。因此，选择不加权因子。转录组数据揭示了小胶质细胞模型中显著的年龄相关转变，与增加的AgeScore相符。尽管简单，AgeScore能够捕捉这些差异，但应辅以详细的标志物分析以捕捉衰老的复杂性。
除了各种年龄标志物增加外，小胶质细胞衰老模型显示基线激活。然而，这与"过度激活"状态无关，而是与应激诱导激活减弱和该细胞类型最重要功能（迁移和吞噬）减少有关。先前研究已经显示小胶质细胞随着年龄增长呈现这些限制。观察到在急性SA诱导应激后诱导HMC3-Progerin细胞中SG形成能力降低。考虑到应激反应脱敏现象，这一悖论可以得到解决。慢性暴露于细胞应激，如由持续progerin表达诱导的应激，可能通过适应性或适应不良机制削弱急性SG组装，如在其他持续应激暴露模型中先前观察到的。此外，诱导HMC3-Progerin细胞的转录组分析揭示了SG相关因子（如CPEB4、EIF2A和ZC3H12A）的失调，表明应激颗粒形成受损的分子基础。也可以设想，细胞骨架改变或RBP功能障碍（两者均为progerin表达的已知后果）阻碍SGs的动态组装和成熟，尽管基础应激负荷升高。
并行，观察到稳态小胶质细胞标志物P2RY12表达一致且显著降低，表明逐渐远离静息、稳态状态。这与衰老小胶质细胞获得更具反应性或疾病相关表型的先前描述一致。转录组数据通过显示与干扰素响应和疾病相关小胶质细胞谱相关的基因特征富集进一步支持这一观点。这些发现强调了衰老过程中小胶质细胞的复杂重编程，其中基础激活与经典应激响应通路和稳态维持的选择性损伤共存。这种失调损害小胶质细胞的重要功能，如吞噬和炎症调节，并促进神经退行性过程。
HMC3-Progerin细胞早衰的RNA测序揭示了反映小胶质细胞衰老几个标志的独特转录组特征。这包括模拟衰老和神经退行性疾病中观察到的免疫激活和状态转变的转录重编程。值得注意的是，与老年人小胶质细胞数据集的比较揭示了重叠的表达变化。此外，GO富集分析突出了与细胞迁移、刺激响应和细胞间通讯相关的通路失调，这些过程对有效的小胶质细胞监视和稳态至关重要。GO分析进一步揭示了参与AGE-RAGE信号通路的错误调节基因，如COL1A、SERPINE1、F3和AGTR1。AGEs是随年龄增长积累的糖化蛋白或脂质，有助于年龄相关疾病和退化。它们的受体RAGE结合多种配体并影响小胶质细胞信号传导，在AD模型中促进炎症和神经元损伤。它还在ALS小鼠中破坏小胶质细胞通讯，将它们转变为有害表型。结果显示AGE-RAGE信号传导的错误调节和衰老小胶质细胞中RAGE增加。需要进一步研究以阐明其在小胶质细胞通讯和衰老表型中的作用。总之，这些发现强调了HMC3-Progerin模型在捕捉功能和转录水平上年龄相关小胶质细胞重编程的效用，并支持其用于研究神经炎症衰老和疾病机制的相关性。
随着年龄增长，核转运因子下调导致核质间蛋白运输受限。此外，NCT中断是衰老细胞的标志。HMC3-Progerin细胞中观察到的转录组变化包括参与NCT的基因表达改变。研究并发现与未诱导对照细胞相比HMC3-Progerin中NCT的普遍干扰。除了衰老，在神经退行性过程中也观察到NCT改变。例如，在许多ALS和额颞叶痴呆（FTD）病例中，RBPs如FUS和TDP43越来越多地错误定位到细胞质，在那里它们可以聚集。到目前为止，这种病理错误定位归因于疾病蛋白本身，要么通过影响NLS/NES的突变，要么通过与输入/输出蛋白的干扰相互作用。在小胶质细胞衰老模型中，鉴定了NCT缺陷以及FUS蛋白的错误定位。这突显了衰老相关变化可能自身导致蛋白质细胞质积累，这在散发性神经退行性疾病中可能特别令人感兴趣。EWSR1和hnRNPA2B1也与ALS有关，但这两种RBPs未呈现NCT缺陷。尽管所有三种蛋白质作为TET家族的RBPs具有结构相似性，但它们在核输入机制和对NCT中断的敏感性上有所不同。FUS包含一个特征明确的PY型核定位信号（PY-NLS）并且高度依赖于Transportin-1介导的输入，这一通路特别容易受到RanGTP梯度或核孔完整性干扰的影响。相比之下，EWSR1和hnRNPA2B1可能依赖部分冗余或更稳健的核输入机制（例如Importin α/β）并且据报道对轻度运输缺陷更具抵抗力。这些差异可能解释了为什么FUS而非其他TET家族成员对progerin诱导的应激和NCT中断以错误定位响应。因此，模型中的FUS错误定位可能作为运输功能障碍和与神经退行性疾病背景相关的早期病理变化的敏感标志。研究结果表明小胶质细胞NCT存在普遍缺陷，差异影响特定蛋白质随年龄增长。这种差异参与可能表明小胶质细胞在各种神经退行性疾病的病理生理级联中发挥 distinct roles。
尽管在永生化小胶质细胞中过表达progerin为模拟细胞衰老提供了有希望的方法，但必须承认几个局限性。首先，虽然progerin诱导衰老相关特征，如核形态异常和增加DNA损伤，但它可能不能完全再现生理衰老的多因素性质。progerin的外源过表达可能导致非生理水平，夸大某些表型， potentially generating在体内未观察到的伪影。此外，使用永生化小胶质细胞系（与原代细胞相比 inherently exhibit altered cell cycle regulation and gene expression）可能干扰一些经典年龄相关过程，如细胞周期停滞，从而限制结果的直接可转化性。此外，该模型主要关注核纤层改变， thereby possibly underestimating其他关键衰老方面，如代谢失调、炎症信号和细胞间通讯。这些局限性强调需要补充方法以实现对小胶质细胞衰老及其对神经退行性影响的全面理解。
尽管如此，开发了具有受控加速衰老的人小胶质细胞体外模型。能够通过progerin表达在HMC3细胞中诱导早衰。早衰HMC3-Progerin细胞呈现多种年龄标志物激活，以及关键小胶质细胞功能（迁移和吞噬）的功能损伤，还有应激响应降低。这些结果与研究中年龄相关转录组变化重叠。还发现早衰小胶质细胞中NCT缺陷，导致几种蛋白质错误定位，包括显著涉及FUS-ALS和FUS-FTD的FUS。这种错误定位可能损害小胶质细胞功能并 potentially contribute to神经退行性过程。未来研究应进一步探索这些发现。尽管如此，HMC3-Progerin衰老模型提供了一个简单的体外方法以研究人类小胶质细胞衰老的潜在机制。
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