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本文揭示转录因子C/EBPα通过上游开放阅读框（uORF）介导的翻译调控机制在脊椎动物中高度保守。通过CRISPR/Cas9技术破坏uORF功能可特异性消除截短型异构体（Tr-C/EBPα），从而释放全长异构体（Fl-C/EBPα）的转录活性，显著延长雄性非洲青鳉鱼寿命（中位寿命提升7.5%，最大寿命延长12%）并改善健康span指标。该研究为衰老干预提供了新的靶点机制。
非洲青鳉鱼（Nothobranchius furzeri）因其短暂的生命周期成为衰老研究的重要模型。这种脊椎动物在自然栖息地中为适应季节性水域而进化出快速生命周期，在圈养环境中表现出明显的衰老特征，包括认知功能下降、组织完整性退化、癌症发病率增加和基因表达谱改变。其基因组已完全测序，并建立了CRISPR/Cas9基因编辑工具。
CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）家族包含六个成员（α至ζ），广泛参与细胞增殖、分化、代谢和衰老过程。C/EBPα和C/EBPβ的蛋白表达在mRNA翻译水平受到独特调控，涉及顺式调节上游开放阅读框（uORF）和从单个mRNA分子翻译产生三种不同长度的蛋白异构体。从长到短，C/EBPα包含延伸型（Ext）、全长型（p42）和截短型（p30）异构体。Ext-C/EBPα在大多数脊椎动物中从非常规CUG密码子翻译，在人类中从GUG密码子翻译，表达水平较低，专门参与激活聚合酶I控制的核糖体DNA转录和细胞大小调控。p42异构体从CEBPA阅读框的第一个AUG密码子翻译，作为完全转录激活因子发挥作用，包含N端转录激活结构域和蛋白质相互作用结构域，以及C端二聚化和DNA结合结构域。p30-C/EBPα异构体从下游框内AUG密码子翻译，依赖于uORF的先行翻译和随后的下游AUG密码子重新起始，缺乏大部分N端转录激活结构域但保留C端二聚化和DNA结合结构域，通过与p42-C/EBPα竞争DNA结合而发挥竞争性抑制剂作用。
先前对C/EBPβ异构体的研究表明，CEBPB基因中的uORF突变（ΔuORF）同样消除了截短型C/EBPβ异构体（C/EBPβ-LIP）的表达，从而释放全长C/EBPβ-LAP异构体的转录激活功能，导致C/EBPβ超级功能。小鼠中的C/EBPβ-ΔuORF突变诱导热量限制型代谢表型，降低自发性癌症发病率，并延长寿命（中位寿命20%，最大寿命10%，仅限雌性）。
mRNA一级结构在脊椎动物进化中高度保守，表现为青鳉鱼与人类、小鼠、鸡、非洲爪蟾和古代腔棘鱼的mRNA序列比对。这种保守性涵盖了uORF的精确定位、翻译起始位点的分布及其相对强度（根据它们与Kozak共有序列的一致性确定），预测了延伸型和全长型异构体的表达以及uORF依赖性截短型异构体翻译。
青鳉鱼基因组包含单拷贝NfCEBPA基因。NfC/EBPα蛋白序列与人类和鸡的C/EBPα蛋白序列比对显示C端区域高度保守，该区域包含碱性DNA结合结构域和亮氨酸拉链二聚化结构域（bZIP结构域）。N端区域也包含与转录激活相关的保守序列，特别是青鳉鱼序列中第36和73个氨基酸之间的结构域，该结构域是C/EBPα独有的，在其他C/EBP家族成员中不存在，确认了序列的C/EBPα身份。两个位于转录激活结构域下游的甲硫氨酸残基预测作为截短型异构体的起始位点，而上游处于有利Kozak背景中的CUG密码子预测作为N端延伸型异构体的起始位点，类似的起始密码子在各个物种中都有观察到。
为分析NfC/EBPα蛋白异构体表达，将NfCEBPA cDNA序列克隆到真核表达载体pCDNA3.1和pSG5中。由于缺乏抗NfC/EBPα抗体，在C末端添加了血凝素（HA）表位。在COS-1、HEK293和Hepa1-6细胞系中转染野生型（wt）cDNA导致三种预期蛋白异构体的表达，标记为延伸型（Ext）、全长型（Fl）和截短型（Tr）。
检查预测翻译起始位点的使用并评估其扰动对NfC/EBPα异构体表达的影响：移除整个5'UTR（Δ5'UTR）导致仅表达Fl-NfC/EBPα，表明额外异构体表达所需的调控序列位于5'UTR内；将uORF-ATG突变为ATC（ΔATG）导致Tr-NfC/EBPα表达缺失；将uORF-ATG转化为最优Kozak序列（ATGOpt）引起Tr-NfC/EBPα上调，证实其表达依赖于uORF翻译；将Ext-CTG密码子突变为CTC（ΔCTG）导致Ext-NfC/EBPα缺失，证明其作为替代起始密码子使用；突变双ATG（ΔATGTr，被认为是Tr-NfC/EBPα异构体的起始位点）导致表达转向更小蛋白，可能由于核糖体扫描至NfCEBPA阅读框中下一个可用AUG密码子，证实双ATG作为Tr-NfC/EBPα表达的起始位点。
为研究从NfCEBPA mRNA表达的截短型NfC/EBPα异构体是否影响NfC/EBPα蛋白的整体转录激活潜力，共转染HEK293T或COS-1细胞与包含两个共有C/EBP结合位点的荧光素酶报告载体以及各种表达载体。ΔCTG突变与野生型NfC/EBPα相比未改变转录激活潜力，可能由于Ext-NfC/EBPα在核仁中聚合酶I介导的rDNA转录中的独特功能。ΔATGuORF突变导致NfC/EBPα转录激活潜力显著增加，可能由于截短型异构体表达减少，该异构体通常与延伸型和全长型异构体竞争DNA结合。相反，ATGuORFopt突变体显示转录激活潜力降低，反映抑制性截短型异构体表达增加。仅表达Tr-NfC/EBPα无法将转录报告基因激活至基础空载体（EV）水平以上。因此，与其他脊椎动物一样，uORF介导的Tr-NfC/EBPα异构体表达缺失导致增强的NfC/EBPα活性。
在ZMZ1001青鳉鱼品系中，使用CRISPR/Cas9基因组编辑通过将uORF-ATG突变为TTG来破坏uORF功能，创建NfCEBPAΔuORF品系。通过测序和PCR分析确认成功突变。将杂合雄性和雌性交配以产生纯合后代。
为检查野生型鱼和NfCEBPAΔuORF突变体之间的寿命差异，监测来自相同杂合交配对的后代。分析合并的雄性队列显示，与野生型雄性相比，NfCEBPAΔuORF雄性的寿命显著延长。具体而言，中位寿命增加7.5%，而最大寿命（定义为每个队列中前10%最长寿鱼的平均寿命）延长近12%。在前10%最长寿雄性鱼中，九条携带ΔuORF突变，而只有三条野生型鱼。雌性野生型和NfCEBPAΔuORF鱼之间未观察到显著寿命差异。比较野生型青鳉鱼，雌性寿命短于雄性，雌性和雄性的中位寿命分别为197天和293天。这些发现表明，ΔuORF突变（增加NfC/EBPα转录激活潜力）为ZMZ1001品系雄性鱼赋予寿命优势，特别是在生命后期阶段，而雌性未显示类似益处。
与野生型鱼相比，NfCEBPAΔuORF鱼未显示可见发育异常，并且在293至321天龄死亡的雄性和176至204天龄死亡的雌性中体长无差异。为评估寿命队列中的健康span，每天两次视觉检查每条鱼，记录外观和行为变化。
在自发死亡的青鳉鱼中，约三分之一为雄性，三分之二为雌性。相反，三分之二的雄性基于人道终点标准被安乐死，而只有三分之一的雌性如此。人道终点指标包括一般外观严重恶化（表明即将死亡），如异常游泳姿势和身体状况差、严重腹部肿胀（腹水）伴鳞片竖起、可见肿瘤进行性生长（常伴身体状况差）、运动显著减少和缺乏食物摄入。在生命末期，雄性比雌性更频繁出现严重体重减轻：野生型和NfCEBPAΔuORF雄性分别为12.50%和20.64%，而野生型雌性和NfCEBPAΔuORF雌性分别为2.22%和4.84%。这些数据表明NfCEBPAΔuORF突变促进衰老鱼体重减轻。腹水表型在雌性中比雄性更常见，基因型间无显著差异。直肠脱垂仅在雌性中观察到，且在野生型鱼中比NfCEBPAΔuORF鱼稍更频繁。可见肿瘤发生率在NfCEBPAΔuORF鱼中显著降低：野生型雄性和雌性分别为10.71%和17.78%，而NfCEBPAΔuORF雄性和雌性分别为4.76%和8.07%。雄性青鳉鱼天生比雌性更多彩，显示与年龄相关的颜色丢失。尽管类似比例的雄性显示颜色丢失，但这在NfCEBPAΔuORF雄性中被延迟。
鱼可能因感染、环境原因和衰老而发展出游泳膀胱功能障碍，表现为异常游泳行为。总体而言，异常游泳行为频率在雄性中显著高于雌性。此外，这些行为发生率在NfCEBPAΔuORF雄性和略低于NfCEBPAΔuORF雌性中较低（与野生型鱼相比）。在NfCEBPAΔuORF雄性中，异常游泳行为的发生显著延迟（与野生型雄性相比），腹部滑动作为最大贡献者也是如此。雌性鱼中未发现显著时间差异。这些结果表明，虽然游泳膀胱功能在雄性鱼中更容易出现与年龄相关的衰退，但这种衰退在NfCEBPAΔuORF雄性中被延迟，表明ΔuORF突变对鱼类衰老过程中的游泳膀胱功能具有潜在保护作用。
鉴于ΔuORF突变影响转录因子功能，预期下游基因调控会发生变化。对来自寿命队列在人道终点终止的NfCEBPAΔuORF和野生型雄性鱼的肝脏、皮肤、大脑和肌肉组织进行比较基因组范围转录组分析。
在NfCEBPAΔuORF鱼的肝脏中，505个基因上调，205个下调；皮肤中125个基因上调，80个下调；肌肉中219个基因上调，152个下调；大脑中49个基因上调，9个下调。
基因本体（GO）术语富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析的功能注释聚类显示，肝脏中上调基因子集富集于与改善健康span和寿命相关的生物过程。对于GO术语分析，这些包括代谢过程、细胞增殖和分化和免疫反应调控。最显著富集（-log10FDR ≥ 4）见于GO术语"ATP代谢过程正调控"、"前体代谢物和能量生成调控"、"胰岛素反应"和"消化"。相反，大脑、肌肉和皮肤中差异表达基因与较少显著富集GO术语相关。在皮肤和肌肉中，仅下调基因贡献于GO术语富集，而在大脑中，仅上调基因与富集GO术语相关。肝脏中上调基因的功能性KEGG通路注释聚类揭示了"长寿调控通路"和"AMPK信号通路"等通路。这些数据表明，至少在肝脏中，已知随衰老衰退的代谢和增殖组织功能在雄性NfCEBPAΔuORF鱼中比野生型鱼更好地维持，并且促长寿通路被诱导。
本研究证明非洲青鳉鱼Nothobranchius furzeri中NfCEBPA基因转录本的翻译产生三种 distinct蛋白异构体：延伸型（Ext）、全长型（Fl）和截短型（Tr）-NfC/EBPα。通过鉴定涉及的翻译起始密码子，确立了Tr-NfC/EBPα表达依赖于小上游开放阅读框（uORF）的完整性。这些特征反映了小鼠、大鼠、鸡和人类中CEBPA直系同源物的报道，强调了CEBPA基因及其C/EBPα蛋白产物在广泛脊椎动物中的进化保守性。通过CRISPR/Cas9介导的基因组修饰破坏青鳉鱼中的NfCEBPA uORF显著延长了雄性NfCEBPAΔuORF鱼的中位寿命（+7.51%）和最大寿命（+11.95），并延迟和减少了各种年龄相关表型。值得注意的是，雌性NfCEBPAΔuORF青鳉鱼未显示类似改善。尽管测试了多个针对与NfC/EBPα序列部分重叠表位的抗C/EBPα抗体，但无一显示足够针对内源性NfC/EBPα的反应性。然而，许多其他物种的C/EBPα和C/EBPβ实验一致证明uORF依赖性调控在细胞培养和整个生物体中同样运作。
在C/EBP转录因子家族中，只有CEBPA和CEBPB共享独特特征：无内含子、包含顺式调节uORF、利用三个替代翻译起始位点产生三种 distinct蛋白异构体（C/EBPα和C/EBPβ）。脊椎动物mRNA序列的比较分析揭示了这些起始位点分布、位置和相对强度的显著保守性，突出了它们的进化重要性。研究表明，uORF驱动的截短型C/EBPα（p30）和C/EBPβ-LIP表达受到mTORC1-4E-BP和eIF2α激酶通路的严格调控，将这些C/EBP与细胞营养和应激信号联系起来。mTORC1信号抑制或eIF2α激酶激活导致截短型C/EBPα（p30）和C/EBPβ-LIP表达抑制。这些共享调控机制表明C/EBPα和C/EBPβ都作为营养、生长因子和应激信号的整合器来协调转录反应。此外，Fl-C/EBPα功能通过乙酰转移酶p300乙酰化和SIRT1去乙酰化连接到乙酰辅酶A和NAD+代谢。响应葡萄糖剥夺，增加的NAD+水平激活SIRT1，后者去乙酰化C/EBPα。低乙酰化C/EBPα将下游转录反应转向参与线粒体生物发生和呼吸的基因。
NfCEBPAΔuORF鱼中最显著表型是可见癌症发生率降低，表明C/EBPα在癌症发展中具有突出作用（类似于CEBPBΔuORF小鼠中的观察）。C/EBPβ-LIP缺陷降低肿瘤发生率，而其过表达增加小鼠肿瘤发生率。此外，C/EBPβ-LIP在几种人类癌症中高表达，包括乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和间变性大细胞淋巴瘤，并且C/EBPβ-LIP过表达在体外和体内诱导细胞转化。机制上，C/EBPβ-LIP通过多种通路支持肿瘤发生，例如通过调节let-7/LIN28B电路诱导向癌症特异性代谢重编程转变（增强糖酵解和线粒体呼吸）。此外，C/EBPβ-LIP促进苹果酸-天冬氨酸穿梭活性，确保癌细胞中NADH/NAD+稳态。除代谢重编程外，C/EBPβ-LIP已被证明在细胞培养中刺激癌细胞迁移和侵袭，表明在转移中的关键作用。
C/EBPα的截短异构体（p30）也与癌症发展有关。在急性髓系白血病（AML）中，CEBPA基因突变频繁产生提前终止密码子，阻止延伸型（Ext-C/EBPα）和全长型（FL-C/EBPα/p42）异构体表达，同时保留C/EBPα-p30异构体不受影响。小鼠实验研究表明，用仅表达C/EBPα-p30的序列替换CEBPA等位基因以完全外显率诱导AML，表明C/EBPα-p30作为癌基因发挥作用。此外，在3T3-L1脂肪细胞中过表达C/EBPα-p30诱导细胞转化。机制上，C/EBPα-p42发挥强抗增殖活性，对p53或Rb等肿瘤抑制因子丢失具有显性优势。相反，截短异构体缺乏这种肿瘤抑制功能，并通过与C/EBPα-p42竞争靶基因启动子和增强子结合促进细胞增殖。C/EBPα诱导细胞增殖和促进癌症发展的特定下游机制和生理过程需要进一步研究。
雄性和雌性NfCEBPAΔuORF鱼均显示异常游泳行为显著减少（与野生型对应物相比）。这些表型通常与游泳膀胱功能障碍有关，可能由感染、环境影响或年龄相关衰退引起。突变鱼中此类行为发生率降低表明对这些挑战的增强韧性。尽管这一发现范围有限，但与CEBPBΔuORF雄性小鼠中的观察一致，后者显示对溃疡性皮炎（C57BL/6小鼠普遍存在）的抗性增加。此外，老年CEBPBΔuORF小鼠显示显著保留的运动协调和更年轻的免疫特征（表现为记忆/初始T细胞比率增加），突出了uORF破坏在这些转录因子中赋予的更广泛健康益处。
在青鳉鱼和小鼠研究中都观察到对遗传修饰的性别特异性表型反应。对此类突变或治疗反应差异通常了解甚少。在实验室动物模型中，遗传背景起着重要作用。例如，本研究中使用的N. furzeri ZMZ1001品系的遗传构成可能显著贡献于观察到的性别特异性反应。类似地，在各种热量限制方案下的遗传多样性小鼠研究揭示了表型变异对遗传背景的强烈依赖性。此外，激素相互作用（全身性和核激素受体-C/EBP相互作用水平）可能在介导性别特异性效应中发挥重要作用。
比较转录组分析揭示了NfCEBPAΔuORF鱼肝脏中710个差异调控基因，其中大多数上调。这可能反映了由于抑制性Tr-NfC/EBPα丢失而增强的转录激活能力。与此一致，我们先前对老年CEBPBΔuORF小鼠（显示增强的C/EBPβ转录激活能力）的研究也揭示了肝脏中以上调基因为主。NfCEBPAΔuORF肝脏转录组的GO术语分析揭示了与健康span和寿命调控潜在相关通路上调，包括参与代谢过程和细胞增殖与分化的通路。代谢性能维持被广泛认为是健康衰老的关键决定因素。此外，与增殖和细胞周期相关的基因通常在青鳉鱼肝脏、大脑和皮肤中随年龄下调。相反，增殖相关基因表达增加与青鳉鱼肌肉中更年轻年龄相关，可能反映组织增强的再生能力。此外，使用KEGG通路分析对上调肝脏基因进行功能注释聚类显示，NfCEBPAΔuORF鱼中长寿调控和AMP激活蛋白激酶（AMPK）信号通路富集。AMPK是关键细胞内能量传感器，通过增加AMP:ATP比率被低能量水平激活。其促长寿功能在从低等脊椎动物到哺乳动物的物种中已确立，并最近在N. furzeri中得到证明。
在NfCEBPAΔuORF鱼的皮肤中，我们观察到与GO术语"免疫反应激活信号通路"和"II型干扰素产生正调控"相关基因表达减少（与野生型相比）。这表明年龄相关低度炎症增加（称为"炎症衰老"）在突变鱼中减弱。
此外，FoxO转录因子基因foxo1和foxo3（已知在物种中促进健康和长寿）的表达在NfCEBPAΔuORF鱼肝脏中上调。此外，几个参与细胞应激反应的基因显示表达增加。这些包括热休克因子基因（hspa1b、hspa1l、hspb6和hsp90aa1）、DNA损伤反应基因（ddit4、sesn1、gadd45a、gadd45b和gadd45g）、未折叠应激反应转录因子基因xbp1和氧化应激反应基因hif1a。应激反应基因上调先前在各种长寿模型中观察到，表明增强韧性可能通过保护 against年龄相关细胞衰退而贡献于改善健康span和寿命。
NfCEBPAΔuORF鱼和CEBPBΔuORF小鼠模型之间可以得出相似之处。在两者中，GO术语"淋巴细胞激活"在肝脏转录组中富集。虽然这一发现的（病理）生理学意义需要进一步阐明，但它提出了肝脏中更有效淋巴细胞介导的衰老细胞清除可能性。此外，两个模型都显示肝脏中参与脂肪分解和β氧化的基因表达增加，例如青鳉鱼中的lpl、cpt1a和ppara，以及小鼠中的类似基因。这表明增强脂肪酸氧化，一种在热量限制模型中也观察到的代谢转变，可能贡献于两个物种中观察到的改善健康span和寿命。
然而，一些结果更难以解释。例如，在NfCEBPAΔuORF鱼的肌肉中，我们观察到与异染色质形成和通过异染色质形成逆转录转座子沉默相关GO术语基因下调。衰老伴随部分异染色质介导沉默丢失，导致逆转录转座子激活。理解这种下调在肌肉功能中的潜在影响需要进一步调查。类似地，基于NfCEBPAΔuORF鱼上调肝脏基因的功能注释分析，胰岛素抵抗作为富集KEGG通路出现。这一发现与通常在几个已建立长寿模型中观察到的增加胰岛素敏感性形成对比。然而值得注意的是，雷帕霉素治疗尽管诱导胰岛素抵抗，但延长小鼠健康span和寿命。在现阶段，尚不清楚突变鱼中观察到的基因表达谱是否对应于实际肝脏胰岛素敏感性降低。
来自寿命队列的转录组样本在年龄和健康状况上都有变化，这可能混淆归因于NfCEBPAΔuORF突变的差异基因表达解释。为更准确剖析NfCEBPAΔuORF突变的直接基因调控效应，需要更受控或简化论实验系统。例如，来自青鳉鱼的成纤维细胞系或使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑生成CEBPA突变细胞系可以提供更受控实验设置来研究增加C/EBPα转录因子功能对不同靶基因的影响。
本研究旨在确认C/EBPα调控的进化保守性，聚焦于其初级mRNA结构，同时提供关于改变NfC/EBPα蛋白异构体表达如何影响健康和寿命的新见解。这些发现与小鼠中C/EBPβ研究一起，强调了进一步研究C/EBP转录因子在促进对抗年龄相关条件和疾病韧性中的重要性。
C/EBPα和C/EBPβ之间的相似性表明在调控贡献于衰老和长寿的细胞过程中具有共享和独特作用。关键未回答问题仍然存在，包括识别由C/EBPα或C/EBPβ独特调控的特定生物过程以及它们功能重叠的那些过程。研究这些转录因子如何整合营养和应激信号通路（如涉及mTORC1、eIF2α激酶和sirtuins的通路）可以揭示环境和代谢线索如何影响它们的活性。此外，C/EBP与其他转录调节因子（如核激素受体）之间的相互作用值得更多关注以理解它们在细胞稳态中的作用。
尽管由于它们的结构特性，在药理学上靶向转录因子具有挑战性，但调控它们活性和/或表达的信号通路代表了有希望的治疗途径。识别C/EBP功能的上游调节因子和剖析它们的机制作用对于制定增强对抗衰老和年龄相关疾病韧性的策略至关重要。最后，在不同模式生物和人类系统中扩展研究对于将这些发现转化为临床应用也至关重要。
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