SPLISOSM方法原理与技术创新
现代空间转录组技术虽然能提供异构体特异性信息，但大多数分析流程仍停留在基因表达水平，忽略了丰富的转录本多样性信息。SPLISOSM通过多元统计检验与非参数核函数，创新性地解决了空间转录组数据中异构体分析的三大挑战：异构体间的相互依赖性、数据稀疏性以及空间自相关性。该方法将空间可变性检测重新构建为多元独立性检验，利用希尔伯特-施密特独立性准则来评估异构体使用与空间坐标之间的非线性依赖关系。
方法的核心突破包括两方面：首先，从数学上证明了所有核检验的低秩近似都会不可避免降低统计效能，这促使团队开发了基于谱图理论的增强空间核，能优先处理代表噪声的高频波动信号。其次，建立了针对稀疏异构体数据的分析框架，通过均值替换策略处理未定义比率，在保持检验有效性的同时优化计算效率。SPLISOSM实现了三种互补的空间可变性检验：HSIC-GC用于总基因表达，HSIC-IR用于异构体使用比率，HSIC-IC用于异构体计数，为异构体水平的空间模式分析提供了全面解决方案。
鼠脑空间剪接模式的特征
在成年小鼠大脑的分析中，SPLISOSM识别出150个在两个重复样本中共享的空间可变处理基因，数量是原先研究报告的两倍以上。这些基因在膜运输和突触信号通路中显著富集，包括Clta 、Cltb 、Snap25 等与神经退行性疾病相关的基因。同时，核糖体基因也表现出广泛的空间可变性，如Rps24 、Rps6 等，这与之前研究中核糖体组成具有细胞类型和组织特异性的发现一致。
在结构水平上，空间可变处理基因显示出3′端附近外显子跳跃的富集以及替代第一个外显子的使用。通过系统搜索与空间可变表达的RNA结合蛋白的差异关联，研究发现包括QKI、RBFOX和CELF家族在内的神经剪接调节因子可能是驱动转录本区域特异性的关键调控因子。特别是Gnas 基因的表现引人注目：其中外显子3在中脑和纤维束中特异性被跳过，该外显子编码的超活跃G-alpha蛋白在SRSF2和U2AF1突变体中被包含时会驱动分化缺陷和髓系恶性肿瘤。
跨平台验证与3′端转录本多样性
研究团队在10X Visium成年小鼠大脑样本中识别出815个具有空间可变转录本3′端多样性使用基因，证明了不同技术平台间检测结果的一致性。Xenium Prime 5K数据集的分析进一步在亚细胞空间分辨率上验证了这些发现，55.6%的ONT检测和39.8%的短读长检测空间可变处理基因显示出显著的空间外显子使用变异性。
值得注意的是，虽然超过80%的空间可变转录本3′端多样性事件定位在3′非翻译区，但在连接点和替代外显子处也发现了显著定位。其中25%的事件与编码区域重叠，具有功能重要性。研究重现了六种先前报道的神经元和胶质细胞之间蛋白质改变性多聚腺苷酸化位点转换，包括Map4 、Atp2a2 、Cdc42 等基因，并提供了它们空间分布的新见解。
人类前额叶皮层的保守转录本多样性
在健康人脑12个10X Visium样本的分析中，研究团队在背外侧前额叶皮层识别出861个空间可变处理基因，证明了跨物种保守性。178个人类空间可变处理基因的小鼠同源物也表现出空间可变性，且保守的转录本3′端多样性区域显示出的序列保守性显著高于不变区域。
功能富集分析强调了异构体水平调控在突触信号传导和伴侣介导的自噬中的重要性，这些过程与各种神经退行性疾病有关。分子调控方面也显示出显著的跨物种相似性，如MAP4 （微管组织蛋白）在两种物种中均表现出对应于神经元与胶质细胞使用的模式。SEPTIN8 提供了另一个进化上保守调控的例证，该基因编码的GTP结合蛋白聚合成丝对细胞结构至关重要。
胶质瘤微环境中的转录本多样性
在24个人类胶质瘤样本的分析中，SPLISOSM识别出306个ONT样本中的空间可变处理基因和2,828个短读长样本中的空间可变处理基因。胶质瘤特异性转录本多样性不仅来自RNA加工，还来自基因组改变。在一个儿科样本中，检测到由可变-多样性-连接重组产生的可变免疫球蛋白转录本，揭示了B细胞浸润的克隆性。
免疫相互作用的重要性进一步凸显，抗原呈递成分在不同样本间持续可变，通常与免疫浸润模式相关。这包括人类白细胞抗原I类和II类基因，其序列变异可能源于选择性剪接和种系变异的共同作用。对于非多态性元件如B2M 和CD74 ，研究发现肿瘤区域优先使用内含子保留的潜在无功能转录本。
微环境影响还延伸至核糖体蛋白，观察到与肿瘤浸润相关的核糖体蛋白转录本的空间可变性，通常涉及保留内含子或截短的3′端。此外，FTH1 （铁存储蛋白）在缺氧肿瘤区域的上调与缺乏最后外显子-外显子连接的3′截短转录本表达增加同时发生，表明氧感应、铁代谢和应激反应通路之间通过转录本水平调节存在协调作用。
讨论与展望
SPLISOSM引入了空间转录组数据分析的异构体中心视角，通过理论基础的核检验方法，在稀疏数据中实现高统计效能。研究表明，标准的3′端测序协议和预先设计的原位面板可以捕获相当多的转录本多样性，使研究人员能够从现有数据集中提取新的见解。
研究结果揭示了RNA结合蛋白（如RBFOX和CELF家族成员）可能通过精确的时空激活来协调转录本多样性。然而，组织和发展阶段的不匹配以及数据稀疏性限制了关联检验的效能，未来需要在适当的神经环境中进行扰动实验来验证和阐明 proposed 的合作机制。
在胶质瘤中，空间转录本多样性受微环境组成和代谢条件的影响。抗原呈递基因中截短和内含子保留转录本的上调暗示肿瘤可能采用替代加工进行免疫逃避。针对这些事件可能增强免疫反应并改善免疫治疗效果。核糖体转录本的显著多样性表明翻译调控可能在肿瘤异质性中发挥未被充分认识的作用，从而暴露出新的治疗脆弱性。
总之，SPLISOSM为空间转录组学分析提供了强大而灵活的计算框架，其在小鼠和人类脑组织中绘制的空间转录本多样性组织图谱，为理解替代异构体加工如何促进特化功能和疾病病理建立了基础。随着空间转录组技术的不断进步和数据质量的提高，SPLISOSM有望在更广泛的组织类型和疾病模型中揭示转录本多样性的空间调控机制。
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