转甲状腺素蛋白淀粉样变性病（ATTR）是一种由转甲状腺素蛋白（TTR）错误折叠形成淀粉样纤维沉积导致的系统性蛋白质构象疾病。这种疾病主要分为遗传型（ATTRv）和野生型（ATTRwt）两种形式，其中遗传型由TTR基因突变引起，而野生型则与年龄增长相关。据统计，全球约有50万ATTRwt患者，在80岁以上老年人的尸检中发现约25%的心脏存在TTR沉积。
目前ATTR的治疗方法主要包括TTR稳定剂和核酸类药物。TTR稳定剂通过阻止TTR四聚体解离和聚集来发挥作用，而小干扰RNA和反义寡核苷酸等核酸类药物则能降低肝脏中TTR的合成。虽然这些治疗方法能够有效降低循环中的TTR水平并延缓疾病进展，但它们都无法纠正潜在的遗传缺陷，且通常需要患者终身定期接受治疗。
近年来，基于CRISPR-Cas9的基因组编辑策略已进入临床开发阶段。NTLA-2001作为一种脂质纳米颗粒递送的mRNA-Cas9疗法，在遗传性ATTR患者中显示出持久的血清TTR降低效果，目前已完成3期临床试验。长期随访数据显示，NTLA-2001能在24个月内维持高达90%的血浆TTR降低率，展现了体内CRISPR疗法的临床前景。
然而，Cas9编辑通过引入双链断裂并经由非同源末端连接（NHEJ）修复，通常会产生小的插入或缺失（indels），有时也会出现罕见的大片段缺失或染色体重排。根据indel的模式，阅读框可能被保留，从而产生可读框内突变（IFMs），这些突变可能产生异常的蛋白质产物。这一局限性促使研究人员探索其他CRISPR系统。
CRISPR-Cas3作为一类1型I-E系统，其特点是含有多亚基Cascade复合物（Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas11和CRISPR RNA（crRNA）），能够识别目标DNA并招募Cas3解旋酶-核酸酶，实现进行性和单向的DNA降解。这与Cas9等2类系统引入的局部双链断裂形成鲜明对比。Cas3通常会在原间隔序列邻近基序（PAM）上游产生长片段缺失，这一特性可能降低产生保留残余基因功能的可读框内突变的可能性。
在这项发表于《Nature Biotechnology》的研究中，研究人员系统评估了CRISPR-Cas3系统对TTR基因的基因组编辑效果。他们通过质粒和mRNA-LNP两种递送方式，在小鼠Hepa1-6细胞、体内小鼠肝脏和人HepG2细胞中检验了Cas3的编辑效率和特异性。此外，研究人员还利用短读长和长读长全基因组测序技术全面分析了脱靶效应，并在TTR外显子人源化小鼠中分析了体内效应，包括血清TTR降低和心脏沉积情况。
研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先通过CRISPR RNA优化筛选出高效crRNA；利用脂质纳米颗粒（LNP）进行体内递送；采用全基因组测序（包括短读长和长读长技术）全面评估脱靶效应；通过靶向捕获测序分析缺失特征；使用人源化TTR外显子小鼠模型进行临床前评价；并通过蛋白质组学分析检测突变TTR肽段。
crRNA筛选与体外编辑效率
研究人员设计了五个靶向小鼠Ttr基因外显子1和2的crRNA候选分子。通过将每个crRNA克隆至全合一质粒（pCas3）中，该质粒共表达哺乳动物密码子优化的Cascade-Cas3复合体和EGFP。转染小鼠肝癌Hepa1-6细胞后，通过流式细胞分选富集EGFP阳性细胞。基因组DNA经PCR和琼脂糖凝胶电泳分析显示，crRNA2在体外对外显子2的编辑效率最高，达到58.9%±0.5%，因此被选用于后续实验。
特异性评估与脱靶效应分析
通过微滴式数字PCR（ddPCR）分析发现，Cas3-crRNA2编辑的细胞中Ttr外显子4等位基因的缺失频率为30.9%±2.2%，而下游B4galt6外显子9仅显示轻微编辑（4.4%±2.0%）。靶向捕获测序显示，Cas3诱导的缺失长度从25bp到74,709bp不等，平均为8,696bp，且缺失起始位点集中在PAM近端Cascade结合位点上游200bp内。
全基因组测序分析表明，Cas3处理样本中在Ttr基因座外检测到的候选缺失区域均对应于重复或低复杂度基因组区域。长读长测序同样显示仅在靶向Ttr基因座有一个主要峰，在潜在脱靶位点或基因组其他位置未检测到显著峰。相比之下，Cas9处理样本在POT1和POT129位点显示出可重复的脱靶indels。
mRNA优化与体内编辑效果
为提高mRNA稳定性和翻译效率，研究人员测试了多种内部核苷酸修饰和5'帽结构的组合。结果显示，Cap1结构能持续增强GFP荧光而不影响细胞活力。基于这些结果，研究人员对所有六个CRISPR-Cas3系统组分采用了类似的修饰，合成了含或不含N1-甲基假尿苷（N1mψ）和Cap1的mRNA。
通过静脉注射含有化学修饰crRNA（TTR2 Stem1 ver2）和Cascade-Cas3 mRNA的LNP给1月龄Jcl:ICR小鼠，研究人员评估了CRISPR-Cas3的体内基因组编辑能力。血清TTR水平的ELISA检测显示，注射后1周，Sep-Cas3-LNP组和DiT-Cas3-LNP组血清TTR水平分别较盐水对照组降低71.3%±7.1%和77.7%±4.1%。这种降低呈剂量依赖性并持续数周。
为进一步提高编辑效率，研究人员在Cascade-Cas3 mRNA中引入了PureCap Cap2修饰。Cap2相比Cap1能将翻译效率提高3-4倍。注射Sep-Cas3-Cap2-LNP使血清TTR降低80.1%±4.6%，表明基因组编辑活性增强。肝脏gDNA的ddPCR分析显示，DiT-Cas3-LNP（6mg kg-1）给药4周后编辑效率为48.7%±1.1%。
免疫原性与耐受性评估
为评估LNP递送系统的潜在免疫原性和肝脏蓄积风险，研究人员在DiT-Cas3-LNP给药后监测了血清细胞因子水平（干扰素-α（IFNα）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白1（MCP1））。细胞因子水平在注射后4小时短暂升高，但1周内恢复至基线水平，与空LNP和盐水对照组相似。Western blot分析显示，Cas3蛋白在给药后4和6小时可检测到，24小时减弱，168小时检测不到，表明蛋白质表达是瞬时的。
人源化小鼠模型中的编辑效果
为评估体内人TTR基因的基因组编辑，研究人员使用了TTR外显子人源化小鼠模型，其中所有小鼠Ttr编码外显子均被人对应外显子替换，而内含子和调控元件仍保持小鼠来源。1月龄外显子人源化小鼠接受单次尾静脉注射DiT-Cas3-LNP或Cas9/NTLA-2001-LNP。两组血清人TTR水平均显著降低：Cas3组降低74.6%±0.6%，Cas9组降低75.9%±0.6%。
通过nanoLC-MS/MS分析，研究人员在Cas9处理小鼠血清中检测到突变TTR肽段（AADAWEPFASGK，IFM4；p.D39_40TdelinsA），但在Cas3处理小鼠中未检测到。AlphaFold2预测显示IFM4改变了TTR单体的局部β-片层结构。体外实验表明，重组IFM4肽段在酸性条件（pH4.5）下聚集性增加，与ATTRv中特征性的V30M变体相似。SDS-PAGE显示IFM4和V30M未能形成四聚体，而野生型TTR可以。
8月龄人源化小鼠接受DiT-Cas3-LNP治疗后1周，血清TTR水平降低77.8%±9.4%。注射后2个月，免疫荧光分析显示心脏TTR沉积和相关巨噬细胞浸润较未处理老年对照组显著减少。
人细胞系中的编辑评估
在人类肝细胞来源的HepG2细胞中，研究人员对靶向人TTR基因的10个crRNA候选分子进行了全面筛选。ddPCR检测显示，crRNA UT05的编辑效率与NTLA-2001无显著差异。RT-qPCR分析进一步确定多个crRNA（包括UT05、UT06和UT07）能产生相当的TTR mRNA降低效果。
全基因组测序比较显示，Cas3处理样本在靶向位点平均缺失大小为3,851bp，最大为43,983bp。质粒递送的Cas3在B4GALT6外显子9诱导13.71%缺失，而mRNA递送的Cas3仅诱导5.02%缺失，与px458递送的Cas9/NTLA-2001观察到的4.93%相当。全基因组特异性评估显示，仅在TTR基因座有一个显著的缺失峰，无其他明显峰。
本研究系统评估了CRISPR-Cas3系统在ATTR治疗中的应用价值。与目前临床主流的Cas9系统相比，Cas3表现出独特的优势：它能产生长片段缺失，有效避免了可读框内突变的风险；在全基因组水平显示出良好的特异性；通过LNP递送实现了高效的体内编辑效果。这些发现为ATTR及其他遗传性疾病的治疗提供了新的技术路径。
虽然Cas9基于的疗法如NTLA-2001仍是ATTR的临床标杆，但这项研究为Cas3作为一种独特且互补的基因组编辑方法提供了初步评估。Cas3的特征性长片段缺失谱及其与Cas9不同的编辑 outcomes，为基因组编辑工具箱增添了重要工具。随着递送技术和编辑特异性的进一步优化，CRISPR-Cas3有望在遗传性疾病治疗领域发挥重要作用。
然而，研究也指出了一些需要进一步探讨的问题。缺失大小的变异性需要仔细考虑；虽然非编码区的低频缺失在观察期内未引起病理变化，但其长期影响尚需明确；不同递送方式产生的缺失谱差异提示需要优化递送策略。此外，全面的安全性研究和长期随访数据对于评估其临床转化潜力至关重要。
总的来说，这项研究证明了CRISPR-Cas3能在人类细胞和小鼠模型中介导高效的基因组编辑，具有特征性的长片段缺失谱。随着技术的不断成熟和优化，CRISPR-Cas3有望成为遗传性疾病治疗领域的重要工具，为患者提供新的治疗选择。
