摘要
弥漫性中线胶质瘤（DMG）是一种高侵袭性、难治性的儿科癌症，主要发生在大脑桥脑干区域，迫切需要开发具有代表性的模型来推动治疗进展。本研究开发了一种FGF4驱动的人脑干类器官模型，并利用其基因工程构建了H3.3K27M突变的DMG。我们证明了脑干桥脑胶质细胞的特化对于DMG的肿瘤发生至关重要，由此产生的浸润性肿瘤再现了患者肿瘤的瘤内异质性。长期的GD2嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗结果与临床观察相似，并揭示了广泛的转录异质性，从中可以识别出强效的效应细胞群和功能失调的细胞群。此外，整合髓系细胞后，生成了DMG特异性小胶质细胞，这些细胞降低了治疗疗效，并揭示了最易受小胶质细胞介导的免疫抑制影响的CAR-T细胞功能状态。因此，我们提出了一个具有代表性的DMG模型，提供了长达数月的体外实验窗口，并利用该模型阐明了CAR-T细胞的功能和小胶质细胞的影响，有助于针对这种毁灭性疾病的疗法开发。
主要内容
弥漫性中线胶质瘤（DMG）的背景与挑战
DMG是一种罕见且具有侵袭性的儿科脑瘤，通常由组蛋白H3基因的体细胞突变引起，最常见的是K27M替换。这种肿瘤在脑干桥脑区域的发生率极高，主要影响10岁以下儿童，其死亡率是所有癌症中最高的，中位总生存期仅为9-15个月。这种恶劣的预后迫切需要更好地理解该疾病的生物学特性以开发有效的治疗方法。
单细胞分析显示，H3K27M突变的DMG具有瘤内异质性，肿瘤细胞谱系范围从停滞的干细胞样少突胶质祖细胞（OPC-like）状态到更分化的星形胶质细胞（AC-like）和少突胶质细胞（OC-like）表型，这些表型与正常的发育细胞类型相似，此外还有一个新近发现的间充质样（MES-like）状态。来自动物和人多能干细胞的研究表明，肿瘤发生存在一个早期的神经发育窗口。因此，后脑发育过程中失调的机制，特别是在负责脑干桥脑形成的区域的胶质祖细胞，可能在驱动H3K27M突变胶质瘤发生中起核心作用。捕捉这种区域特异性的胚胎模式对于准确模拟桥脑DMG至关重要。
人脑干类器官（BrO）模型的建立
为了生成具有适合DMG建模的后脑脑干特性的人体类器官，研究人员应用了时序性的形态发生素引导，使用了Wnt、双重SMAD抑制剂、视黄酸（RA）、成纤维细胞生长因子（FGFs）和音猬因子（SHH）的适时序列。与使用FGF2和FGF8结合RA和Wnt来模式化中脑、小脑或脊髓的类器官不同，本研究评估了FGF4的作用，因为它在指定前脑脑干，特别是桥脑区域中起作用。与常见的FGF2补充相比，在模式化第7天后用FGF4替代，证明10 ng ml-1 的FGF4能特异性促进桥脑（包括前桥脑到后桥脑区域）的发育。
通过时间进程的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，从第5天到第120天，研究人员恢复了55,327个高质量细胞。使用基于艾伦脑图谱中小鼠原位杂交数据的工具VoxHunt进行空间相似性映射，确认了类器官具有后脑特性，并显示出更显著的桥脑特征。细胞注释显示，类器官模型包含了从多能干细胞到神经上皮和放射状胶质细胞，以及在第14天和第60天分别出现的不同神经元和胶质细胞群的转变，反映了神经发生和胶质发生阶段的自然分离。与人类神经类器官细胞图谱（HNOCA）相比，脑干类器官（BrO）在胶质谱系，特别是胶质母细胞和OPC方面显示出显著富集。重要的是，与人类发育脑细胞图谱（HDBCA）的比较显示，BrO显著覆盖了胶质细胞簇，其中13个增加的簇表现出桥脑和延髓特异性身份。因此，新生成的BrO模型为研究桥脑延髓区域特异性背景下的胶质生成提供了一个实验框架，对DMG建模具有重要意义。
新生生成H3.3K27M突变DMG模型
为了研究BrO是否能用于模拟DMG肿瘤，研究人员将表达最常见的H3.3K27M定义性DMG突变的质粒，连同典型的伴随突变和桥脑特异性肿瘤抑制因子TP53和血小板衍生生长因子A（PDGFRA）的 alteration，通过原位电穿孔技术引入发育中的BrO。测试了第11天到第28天之间的不同电穿孔时间点，确定第11天是最高效诱导肿瘤性生长的时间点。在这个发育阶段，BrO中以放射状胶质细胞和神经上皮干细胞样细胞为主，这与早期研究将神经干细胞识别为H3.3K27M驱动的肿瘤转化的许可细胞状态相一致。
追踪肿瘤生长超过2个月显示，产生的肿瘤表现出浸润性生长。相比之下，使用空载体对照质粒仅导致少数局部电穿孔细胞。在第16周（电穿孔后4个月）进行的全类器官3D成像，按侵袭深度进行颜色编码，进一步证实了DMG特有的弥漫性生长模式。此外，将DMGOs原位移植到免疫缺陷小鼠体内后，能够在体内进展，表现出侵袭性生长。H3.3K27M表达与显性阴性TP53（DNp53）和PDGFRA-D842V在蛋白质水平上的量化显示，大多数GFP阳性细胞都整合了所有三种突变。这些发现说明了DMG在我们引导的脑类器官中的侵袭性生长依赖于通常观察到的组合驱动突变。
具有代表性的DMG模型及桥脑特异性OPC状态
为了进一步评估我们体外培养的肿瘤模型（DMGO）的代表性，我们进行了与具有相同突变谱的患者样本的组织学比较。结果显示，H3.3K27M阳性细胞（H3K27M+ ）在患者样本和DMGOs中均显示H3K27三甲基化（H3K27me3）的缺失，这是H3K27突变DMG的标志。此外，我们体外培养的肿瘤表现出与DMG高度相似的全局甲基化谱，从而将我们的肿瘤与胶质母细胞瘤和具有类似H3K27M三甲基化缺失的后颅窝（PFA1和PFA2）室管膜瘤区分开来。
接下来，我们对分选的GFP+ 肿瘤细胞进行了scRNA-seq分析，在质量控制过滤后，分析了来自14个DMGOs的大约7,000个细胞。从scRNA-seq数据推断的拷贝数变异（iCNV）分析进一步支持了这些细胞的恶性状态，显示与健康细胞相比，这些细胞存在大规模扩增和缺失，包括10号和13号染色体的缺失以及19号染色体长臂（19q）的获得。使用已发表的DMG参考文献，我们首先注释了先前描述的DMG癌细胞状态，包括OPC样、AC样和MES样细胞状态以及一群循环细胞。与我们模型的早期发育窗口一致，我们只识别出少数具有更成熟OC样表型的细胞。重要的是，我们识别出大部分OPC样肿瘤细胞类似于最近定义的OPC样2和3状态，这两种状态都被描述为儿科和桥脑特异性的前OPC状态。此外，我们发现DMGOs与原发性DMG患者材料之间的相似性评分最高，而不是与细胞系、患者来源异种移植模型（PDX）以及来自胶质母细胞瘤或两种PFA亚型患者的材料相比。总之，这突显了DMGOs能够高度模拟原发性DMG肿瘤的能力。
桥脑胶质特异性DMG肿瘤发生
我们研究了驱动肿瘤发生的机制，以确定BrO中哪些属性对于支持DMG肿瘤生长至关重要。我们使用了TrackerSeq，一种基于PiggyBac的遗传谱系追踪方法，并在电穿孔后2个月分析了癌症克隆动力学。我们检索了来自6个DMGOs和2个健康BrOs的167个独特条形码，并检测到单个克隆最多可涵盖约800个细胞，指示了癌性转化。通过比较大克隆与小克隆的差异表达基因（DEG）和METASCAPE分析，我们确定胶质特化是驱动癌症克隆扩增的关键特征，而与神经元特化（例如，突触组织和化学突触传递的调节）相关的基因在小克隆中富集。大克隆的特征是OLIG1（一种经典的OPC标记物）以及IER2、JUNB、FOS和EGR1的更高基因表达，这些基因先前被描述为OPC样3前OPC状态的关键标记物。有趣的是，我们还发现AQP1的表达更高，这是一种水通道蛋白，先前被证明在人类脑干中仅存在于星形胶质细胞中。此外，对患者数据的分析显示，AQP1在位于桥脑的肿瘤中表达，但在来自皮质或丘脑区域的肿瘤中不表达。这些数据暗示了一种胶质特异性的肿瘤发生过程，并且该过程进一步依赖于桥脑的位置。通过将大DMG肿瘤克隆中上调的基因映射回BrO的胶质谱系，进一步说明了这一点，表明肿瘤发生依赖于胶质生成。为了通过实验证实这一点，我们在非引导的脑类器官中进行了突变组合的原位电穿孔，结果显示肿瘤诱导减少。此外，其生长是非弥漫性的，几乎很少有携带H3.3K27M替换的GFP阳性肿瘤细胞。这些发现表明，H3.3K27M驱动的肿瘤发生依赖于正确的解剖细胞身份，而我们的BrO模型再现了这一点。
共识非负矩阵分解（cNMF）和谱系关系分析确定恶性元基因程序1和2存在于最多数量的克隆中（34个克隆中的30个和26个），并且属于OPC样谱系，强调了该谱系在H3K27M DMG肿瘤发生中的核心作用。更具体地说，我们显示了与前OPC状态，即OPC样2的重叠。在人类早期妊娠的背景下，胶质谱系的区域特异性基因特征被认为是以胶质相关疾病（如DMG）的强烈区域特异性发生模式为基础。与此一致，程序1和程序2都特异性地富集了后脑桥脑少突胶质细胞前体谱系，而不是中脑和前脑谱系。总之，这些发现突出了桥脑胶质特化（在BrOs中被捕获）在驱动DMG肿瘤发生中的作用，强调了在模拟DMG和建立与人类相关的治疗测试实验系统时，空间和发育精确性的必要性。
模拟CAR-T细胞异质性及功能耗竭
鉴于在DMGOs中观察到的相关肿瘤进展，我们评估了它们作为临床前测试GD2 CAR-T细胞的人体体外平台的潜力。通过将未转化的BrOs暴露于GD2 CAR-T细胞，我们首先通过明场成像直观检查了GD2 CAR-T细胞的存在不影响模型的总体健康状态。接下来，我们确认了DMGO中GD2靶标的表达以及通过共聚焦成像检测GFP+ 肿瘤细胞中cleaved caspase 3所证实的肿瘤细胞杀伤作用。建立了这些实验前提后，我们在肿瘤诱导后4个月对DMGOs进行治疗，在第0天和第7天施用CD8+ GD2 CAR-T细胞，并随时间监测T细胞活化（通过干扰素-γ（IFNγ）分泌测量）和肿瘤控制。与个体中报告的异质性结果相似，我们观察到肿瘤负荷总体部分减少，并且个体DMGOs之间的反应率存在异质性。由于所有治疗的DMGOs都通过强大的IFNγ反应显示出明显的GD2 CAR-T细胞活化，有限的反应谱不太可能是由于抗原识别不足所致。治疗效应在治疗超过1个月后仍可检测到，这为在体外模拟CAR-T细胞功能提供了优势，能够代表体内肿瘤部位的T细胞状态，包括与长期肿瘤暴露相关的潜在耗竭特征。
为了测试我们的模型用于此目的，我们对从DMGOs中回收的超过20,000个GD2 CAR-T细胞以及未暴露的GD2 CAR-T细胞进行了测序。这揭示了DMGO暴露诱导了相当程度的异质性。在从DMGOs回收的GD2 CAR-T细胞中，我们识别出九个转录状态，基于对精选基因特征的组合 interrogation、差异表达基因（DEG）、DEG相关的基因本体论（GO）术语、经典免疫效应物和耗竭标记物的表达以及与包括脑恶性肿瘤在内的泛癌肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）数据集的比较，反映了不同的T细胞活化、分化和效应状态。例如，我们识别出一个GD2 CAR-T细胞群体，尽管被活化（基于HLA基因表达），但并未完全分化为效应功能（未分化；TUND ），以及一个IL-2反应群体（TIL-2 ），可能分化为效应T细胞。此外，我们观察到一个表达干扰素刺激基因（ISG）的群体（TISG ），对应于表达ISG的TILs，并被认为是干扰素诱导的活化状态。其他簇包括具有迁移特性和互连性的CAR-T细胞群体，其似乎受其神经元环境影响，以及增殖（TPR ）和代谢应激的T细胞（TMS ）。重要的是，我们根据其细胞毒性特征和假定的耗竭水平区分了潜在的DMG靶向效应T细胞群体。虽然其中一个簇主要表达GZMK（TGZK ），但细胞毒性T细胞（TCYT ）表达GZMB、PRF1和IFNG。相比之下，耗竭T细胞（TEX ）显示IFNG减少，并同时表达免疫检查点基因LAG3、HAVCR2、TIGIT和SELPLG，以及与耗竭相关的转录抑制因子PRDM1。每周施用CAR-T细胞（第0天和第7天）并未改善TEX 的减少或TCYT 的富集，表明耗竭可能早在第7天就已出现。
为了确认在我们的DMGO模型中检测到的耗竭反映了肿瘤部位代表性的T细胞耗竭，我们将DMGO暴露后存在的TEX 表型与暴露前的GD2 CAR-T细胞进行了比较，后者尽管通过4-1BB胞内结构域得到缓解，但仍可能显示出由强直信号传导导致的耗竭特征。确实，一部分暴露前的GD2 CAR-T细胞与我们暴露于DMGO后检测到的TEX 簇重叠。然而，根据实验条件分离该簇中的细胞显示，DMGO暴露的TEX 上调了广泛的额外耗竭标记物，以及已知的耗竭转录因子和功能调节因子，这些因子包括在跨TIL数据集的癌症患者中描述的那些。此外，与在抗原驱动的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒小鼠慢性感染模型以及基于持续抗原暴露的CAR-T细胞功能障碍体外模型中发现的耗竭标记物的重叠，证明观察到的耗竭特征是抗原驱动的。对于体外模型系统，这在天然表达的肿瘤抗原背景下尚未实现，仅能通过持续的抗CD3和抗CD28抗体刺激或使用抗原脉冲或过表达的肿瘤细胞系进行多轮刺激来实现。因此，DMGOs模拟了CAR-T细胞的功能异质性，包括代表性的T细胞功能耗竭，这是改善结果的可操作轴，因此是临床前评估的关键因素。
NCAM1筛选短寿命细胞毒性效应CAR-T细胞
与其强大的细胞毒性和缺乏耗竭一致，TCYT 群体与我们最近识别的“超级接合者”工程化T细胞的“杀手”基因特征重叠，这些细胞在短期共培养测定中具有深远的肿瘤靶向能力和连续杀伤行为。由于我们先前将NCAM1识别为富集该群体的选择标记物，我们利用此策略进一步研究这种CAR-T细胞功能谱在长期治疗设置中的相关性。我们在DMGO治疗前基于NCAM1表达分选了GD2 CAR-T细胞，并比较了NCAM1+ 和NCAM1- 细胞之间的肿瘤控制。这证明了NCAM1+ GD2 CAR-T细胞最初的强效抗肿瘤活性，在第2天，其肿瘤控制比NCAM1- GD2 CAR-T细胞富集了1.4倍。然而，这种增强的效力在第5天到第7天之间趋于稳定，NCAM1- T细胞随时间推移显示出更渐进的抗肿瘤活性，到第7天时略微优于NCAM1+ 细胞，这与在第14天回收到更多NCAM1- 细胞一致。为了深入了解解释这些差异结果的潜在转录组谱，我们对NCAM1- 和NCAM1+ GD2 CAR-T细胞进行了scRNA-seq，并将它们映射回我们先前识别的GD2 CAR-T细胞特征。这揭示了一个额外的应激GD2 CAR-T细胞簇，特异于NCAM1- 细胞（THS ），其通过热休克蛋白的表达与TMS 簇区分开来，并与在TILs中识别的、与免疫治疗耐药相关的应激反应状态重叠。进一步与最初观察到的增强的肿瘤控制一致，NCAM1+ 细胞显示TCYT 比NCAM1- 细胞富集了3.3倍。然而，与细胞持久性差一致，NCAM1+ T细胞还富集了TEX ，这解释了它们随时间推移性能下降的原因。总之，这将NCAM1+ 细胞识别为一个强效的肿瘤靶向、但短命的效应GD2 CAR-T细胞群体，并提供了在给药前通过细胞选择来缩小CAR-T细胞功能异质性的概念验证。
富含小胶质细胞的DMGO微环境
与组织驻留相关的特征的上调，包括用于识别组织驻留T细胞的经典标记物CD103（ITGAE），强调了DMGOs模拟组织内T细胞性能的能力。虽然这可能为增强CAR-T细胞运输和组织驻留的策略提供信息，但DMGOs缺乏髓系区室，这是T细胞反应的关键调节器。因此，为了增强DMGOs的复杂性，我们整合了小胶质细胞，这是DMG肿瘤微环境的一个主要组成部分。我们从hES细胞生成了原始巨噬细胞祖细胞（PMPs），先前已证明其能在小鼠大脑和人中脑类器官中分化为成熟小胶质细胞，并在与神经元共培养时也能如此。PMPs类似地整合到BrOs中，并在7天内呈现出稳态小胶质细胞特征的分支形态。确认功能成熟后，这些细胞表现出典型的小胶质细胞行为，迁移到髓鞘注射部位，并通过吞噬作用清除髓鞘。此外，在整合到BrOs中3周后，超过80%的细胞在蛋白质水平上表达小胶质细胞特异性标记物P2RY12，并且scRNA-seq分析证明小胶质细胞特异性转录因子的表达增加。此外，当参考小鼠中识别的小胶质细胞发育程序时，它们类似于成年状态，进一步验证了小胶质细胞的成熟。与来自DMG肿瘤的髓系细胞参考数据集的比较确认了小胶质细胞而非巨噬细胞的身份。
在肿瘤携带的DMGOs中整合小胶质细胞导致获得了最近描述的DMG相关功能表型，包括干扰素活化、吞噬脂质和缺氧状态。此外，与BrOs相比，来自DMGOs的小胶质细胞显示出与抗原呈递和免疫反应相关的GO术语富集，例如主要组织相容性复合体II类介导的肽加工和I型干扰素反应，这些先前被描述为在DMG相关的小胶质细胞和巨噬细胞中上调。这些DMG特异性小胶质细胞状态伴随着趋化因子表达的减少和与免疫抑制谱相关的基因的上调，这与患者数据一致。这通过CD163（与抗炎状态相关）和SPP1（与免疫抑制的脂质负载巨噬细胞相关）的蛋白质表达得到证实。总之，这些发现表明，在适当的神经元环境中，PMPs分化为成熟的小 胶 质 细 胞 ，
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