背侧中缝核VIP神经元在生存导向的警觉性中的关键作用：协调睡眠稳定性和威胁防御行为的神经环路机制

本文聚焦于背侧中缝核（DRN）中表达血管活性肠肽（VIP）的多巴胺能（DA）神经元亚群（DRNVIP），揭示了其在调控睡眠-觉醒周期稳定性及生存导向的威胁评估与防御行为中的核心作用。研究通过基因消融、光遗传学、化学遗传学及光纤光度测定等技术，证实DRNVIP神经元通过一个涉及中央杏仁核（CeA）和终纹床核卵形部（ovBNST）的反馈环路，充当“神经元警报系统”，在视觉威胁线索出现时被特异性激活，从而协调风险评估与适应性防御反应。该发现为理解焦虑、睡眠障碍及相关精神疾病的神经环路基础提供了新视角。

²结果

^2.1DRN_VIP神经元是小鼠和非人灵长类动物中DRN_DA神经元的一个亚群

研究聚焦于背侧中缝核（DRN）中表达血管活性肠肽（VIP）的多巴胺能（DA）神经元群体。原位杂交结果显示，在C57BL/6小鼠的DRN中，约50%的酪氨酸羟化酶（Th）阳性mRNA细胞同时表达Vip mRNA。在这些Vip阳性神经元中，绝大多数（83%）共表达Th。利用Vip-Cre转基因小鼠系进行特异性靶向，进一步证实了这些细胞的多巴胺能身份：91%的靶向细胞表达Th，并且全部（100%）与Cre重组酶共定位。值得注意的是，虽然原位杂交鉴定出这种多巴胺能表型，但对VIP表达神经元进行TH免疫染色显示，TH酶的蛋白表达水平低于预期，这表明VIP神经元表现出低水平的TH蛋白，与其他多巴胺能群体中的观察结果一致。

使用Cre依赖的病毒方法结合AdipoClear组织透明技术，研究人员选择性靶向了DRN_VIP神经元并表征了这些神经元的解剖学分布。DRN_VIP神经元群体的整体组织类似于“蟹钳”状，具有致密的后部和中间区域，并伴随两个延伸：一个背侧分支和一个腹侧分支，均朝向吻侧。这些DRN_VIP神经元沿着西尔维乌斯水管的外侧和腹侧边缘分布，跨越从前囟后-3.80毫米到-5.00毫米的前后轴。对透明脑样本中GFP阳性细胞体的量化显示，每个大脑平均有516个GFP阳性神经元。

为了研究DRN_VIP群体在其他物种中的存在，研究人员对非人灵长类动物的冠状脑切片进行了VIP免疫染色。非人灵长类动物的DRN_VIP神经元表现出与小鼠相似的分布，沿着西尔维乌斯水管的外侧和腹侧区域排列。值得注意的是，DRN中TH和VIP的双重免疫组织化学显示这些标记物之间存在高度共定位，这与在小鼠中观察到的有限重叠形成对比。

^2.2DRN_VIP神经元通过反馈环路战略性地位于影响中央延伸杏仁核的位置

DRN_DA神经元投射到多个区域，包括BNST、CeA、BLA、VTA和下丘脑。使用在DRN注射AAV-EF1a-DIO-eYFP combined with the AdipoClear tissue-clearing technique，研究人员观察到DRN_VIP神经元具有高度受限的投射模式，有两个主要输出靶点：终纹床核的背外侧部分（dlBNST），包括卵形核（ovBNST）和囊旁核（juBNST），以及中央杏仁核（CeA），特别是其外侧部分。通过将AAV5-EF1a-DIO-synaptophysin-GFP病毒注射到Vip-Cre小鼠的DRN中，证实了在BNST、CeA、岛叶皮质和后基底外侧杏仁核（BLP）中观察到的标记对应于突触标记而非过路纤维。在非人灵长类动物中的VIP免疫染色显示在ovBNST和CeA中存在显著的VIP阳性纤维。

在透明的小鼠大脑中，GFP阳性纤维腹侧离开DRN，加入内侧前脑束（MFB），到达BNST，在那里观察到突触接触。这些纤维然后背侧穿过终纹去支配CeA，更尾侧地支配BLP。AdipoClear成像还发现纤维在到达BNST之前从MFB分出，通过内囊直接到达CeA。次级输出靶点包括BLP和岛叶皮质。荧光定量分析证实了向dlBNST和前BNST的强投射，外侧CeA在杏仁核各核团中显示出最高的荧光强度。这些结果表明，与整个DRN_DA相比，DRN_VIP神经元具有更受限的投射模式，特定区域如BLA被排除在靶点之外。来自透明脑样本的图像强烈表明，DRN_VIP神经元的轴突顺序性地支配BNST然后CeA。

为了确认单个DRN_VIP神经元可以同时投射到BNST和CeA，研究人员采用了改良的狂犬病毒追踪策略。使用缺乏糖蛋白的Cre依赖辅助病毒，以及两种分别注射到ovBNST和CeA的狂犬病毒，在DRN中观察到双标记的细胞体。这一发现证实了DRN_VIP神经元投射到BNST和CeA。

^2.3ovBNST_PKC-δ和CeA_PKC-δ是DRN_VIP神经元的主要突触输入

为了研究DRN_VIP神经元嵌入的环路，研究人员在Vip-Cre小鼠中采用了基于狂犬病毒的跨突触追踪方法来绘制它们的突触前输入。追踪实验揭示，只有两个主要脑结构为DRN_VIP神经元提供大量输入：ovBNST和外侧CeA。虽然额外的输入来自主要位于下丘脑和脑桥的区域，但这些投射相对稀疏。

先前的研究已经确定ovBNST和CeA内有两个主要、不重叠的神经元群体：一个表达蛋白激酶C delta（PKC-δ），它共表达D2多巴胺受体；另一个表达促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）。由于PKC-δ神经元在ovBNST和CeA中构成最大的亚群，研究人员进行了PKC-δ免疫组织化学以表征投射到DRN_VIP神经元的神经元身份。分析显示，狂犬病毒标记的神经元与PKC-δ表达之间存在极高的共定位程度，在ovBNST中为95.6%，在CeA中为95.4%。这些发现揭示了一个高度特化的环路，其中DRN_VIP神经元接收来自两个GABA能结构（ovBNST和CeA）的密集输入，同时投射回这些相同区域，形成一个受限的反馈环路。

^2.4DRN_VIP神经元释放谷氨酸

DRN_DA神经元已被证明在下游结构中共同释放多巴胺和谷氨酸。这里，研究人员调查了DRN_VIP神经元是否也释放谷氨酸。为此，他们使用了Vip-Cre/COP4 mice，其中通道视紫红质选择性表达在VIP表达神经元中。制备了含有DRN、ovBNST和CeA的脑切片，将蓝色发光光纤置于DRN细胞体上方以确认光刺激时的去极化，或置于ovBNST和CeA的突触末端上方以评估神经递质释放。

研究人员通过记录光刺激引起的内向电流验证了通道视紫红质在DRN_VIP神经元中的表达。光遗传学刺激显示，ovBNST中45%的记录神经元有反应，而CeA中只有14%有反应。所有有反应的神经元都表现出兴奋性突触后电流（EPSC），表明是谷氨酸能表型。此外，添加AMPA和NMDA受体拮抗剂（DNQX和AP5）消除了这些电流，证实DRN_VIP神经元在这两个结构中释放谷氨酸。此外，这些连接似乎是单突触的，因为添加TTX（电压门控钠离子通道阻滞剂）会导致信号丢失，随后添加4-AP（钾离子通道阻滞剂）后信号恢复，在ovBNST和CeL中都是如此。突触传递表征显示，在ovBNST和CeA神经元中，EPSC振幅较低且存在突触抑制。鉴于这些区域的主要神经元群体表达PKC-δ，研究人员检查了DRN_VIP神经元是否优先靶向表达PKC-δ的细胞。PKC-δ的免疫染色显示与生物胞素填充的神经元高度共定位，在ovBNST中达到82%，在CeA中达到66%，表明DRN_VIP神经元主要支配表达PKC-δ的细胞。

^2.5DRN_VIP神经元消融导致睡眠稳定性改变

DRN_DA神经元的群体活动与睡眠-觉醒状态密切相关，并且这些神经元的化学遗传学抑制会降低对外部刺激的反应性，损害从睡眠中觉醒的能力。此外，针对这些细胞的化学损伤会导致严重的嗜睡症发作。基于这些发现，研究人员调查了消融DRN_VIP神经元是否会通过改变觉醒和睡眠状态之间的平衡来破坏睡眠结构。具体来说，他们假设调节这些神经元的活动可能影响NREM发作的稳定性和持续时间，最终影响整体的睡眠-觉醒周期。

为了确定DRN_VIP多巴胺亚群是否对睡眠-觉醒调节产生独特影响，研究人员使用AAV5-EF1a-FLEX-taCaspase3 viral construct（Casp3）选择性消融了DRN_VIP神经元，而对照小鼠在Vip-Cre小鼠的DRN中接受AAV5-EF1-DIO-eYFP virus（Ctrl）注射。组织学分析证实Casp3消融有效消除了DRN中的VIP阳性神经元。此外，ovBNST和CeA中的VIP和TH纤维密度显著降低，进一步支持了DRN_VIP神经元的多巴胺能表型，尽管其胞体中TH表达较低。当比较雌性和雄性小鼠中VIP阳性和TH阳性神经元的数量时，研究人员注意到对照雄性小鼠的神经元数量高于对照雌性小鼠。雌性和雄性小鼠之间没有观察到其他差异。

caspase诱导的DRN_VIP神经元消融导致在24小时记录期的活动期睡眠结构发生显著改变。具体而言，NREM睡眠发作的次数减少，而其平均持续时间增加，导致与对照相比睡眠稳定性增强。这种稳定性的增加与NREM纺锤波的变化同时发生，NREM纺锤波是短暂的10-15 Hz振荡事件，涉及感觉输入调节和自发性睡眠中断。研究人员观察到纺锤波持续时间显著增加，同时有证据表明纺锤波密度对NREM睡眠调节有贡献。重要的是，总NREM睡眠时间保持不变，排除了白天过度嗜睡的发生。与NREM发作次数减少一致，研究人员观察到清醒状态的发作次数减少。在清醒持续时间或REM睡眠方面没有观察到差异。

^2.6DRN_VIP神经元消融改变焦虑相关测试中的风险评估

BNST和CeA在威胁监控中起着关键作用，包括焦虑样行为、风险评估和防御反应。鉴于研究发现ovBNST和CeA（外侧部分）是DRN_VIP神经元的两个主要突触靶点，研究人员采用相同的基因消融方法来研究它们在焦虑、风险评估和防御行为中的作用。为了评估这些神经元的丧失如何影响BNST和CeA活动，研究人员进行了体内单细胞电生理记录。DRN_VIP神经元的基因消融导致这两个区域的神经元放电频率显著增加。

为了检查DRN_VIP神经元消融的行为后果，研究人员使用旷场测试（OFT）、高架十字迷宫（EPM）和明暗箱（L/D box）评估了焦虑相关和风险评估行为。在OFT中，Casp3小鼠和对照小鼠之间没有观察到差异。在EPM中，Casp3小鼠在开放臂（OA）中花费的时间显著减少，并表现出更多的受保护头部探视，表明风险评估行为增加。然而，在其他风险评估或焦虑相关指标上，如伸展- attend姿势（SAP）、中心时间、闭合臂进入次数或总移动距离，没有发现差异。在L/D box测试中，Casp3小鼠在明室的时间没有减少，并且所有测量变量与对照组相比没有显著差异。除L/D box测试外，雌雄小鼠之间没有观察到差异，在L/D box测试中观察到对照和Casp3小鼠均存在性别效应，这可能与测试本身有关，而非DRN_VIP神经元消融所致。

^2.7DRN_VIP神经元是适应性地逃避视觉威胁所必需的

BNST对于威胁预期至关重要，特别是在应对不确定威胁时。为了评估Casp3小鼠的这一功能，研究人员采用了视觉 looming 测试（VLT）。在这项任务中，当小鼠进入指定区域时，会触发一个模仿接近捕食者的视觉刺激，促使逃跑或其他防御行为。Looming刺激经过特殊设计，以 favor 逃跑反应 over freezing。与对照组相比，Casp3小鼠在所有三个测试日中的逃跑概率显著降低。对照小鼠在74%的试验中表现出逃跑反应，而Casp3小鼠仅在40%的试验中逃跑。此外，逃跑活力（量化为返回庇护所的速度）在Casp3小鼠中降低。虽然对照小鼠以增加的速度返回庇护所，但Casp3小鼠在外出行程和逃跑期间以相似的速度移动。第一次逃跑试验的逃跑潜伏期在组间相似，并随着重复测试而减少。

除了逃跑概率降低外，Casp3小鼠在庇护所中花费的时间更少，在触发区花费的时间比对照小鼠更多。由于对照和Casp3小鼠在VLT第一天都暴露在视觉线索7到10次之间，研究人员假设VLT室在第二天获得了厌恶效价。然而，在VLT第二天（H2）的适应期期间，组间在触发区花费的时间没有显著差异。为了进一步研究风险评估，研究人员量化了 rearing 行为，这是VLT中的一个相关测量，因为视觉刺激模仿空中的头顶捕食者。在第一天（H1）的适应期间，组间没有观察到 rearing 行为的差异；然而，Casp3小鼠在视觉线索之前和之后都进行了显著更多的 rearing，表明风险评估增加。为了评估防御反应，研究人员测量了刺激开始后7秒内的累积不动时间。Casp3小鼠花费的不动时间显著少于对照组。重要的是，组间在一般运动活动方面没有观察到差异。

研究人员试图确定长期分子或突触后补偿，而不是DRN_VIP输入本身的丧失，是Casp3小鼠行为表型的原因。为了排除这种可能性，研究人员在每次视觉线索呈现时通过光遗传学瞬时抑制DRN_VIP神经元，重复了视觉 looming 测试。注射视蛋白eNpHR的小鼠在第一天的逃跑概率低于对照小鼠。在第一天，eNpHR小鼠逃跑的概率为14%，而对照小鼠为34%。eNpHR小鼠和对照组之间其他测量变量没有差异。组织学分析证实了DRN中mCherry的表达和光纤的正确放置。对于逃跑概率，使用未配对单尾t检验进行统计比较。这种方法基于一个强有力的先验定向假设，预测光遗传学抑制DRN_VIP神经元后逃跑概率降低，这直接基于我们的基因消融实验。使用双尾检验未达到统计学显著性，可能是由于光遗传学实验中对照组的基线逃跑概率低于基因消融实验。研究人员将这种差异归因于光纤的存在，这可能会影响基线行为。然而，相对于其匹配的对照，DRN_VIP神经元的光遗传学抑制仍然产生了逃跑反应的显著减少。这些结果共同支持了在Casp3小鼠中观察到的逃跑概率降低主要归因于DRN_VIP神经元活动的丧失，而不是适应性变化。

^2.8DRN_VIP神经元的化学遗传学激活增加对Looming威胁的逃跑反应

caspase实验的结果显示对 looming 威胁的反应适应不良，证据是逃跑概率降低。研究人员随后假设，使用兴奋性化学遗传学方法增加DRN_VIP神经元的兴奋性将提高VLT中的逃跑概率。研究人员在Vip-Cre小鼠的DRN中注射了AAV1-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mCherry 或对照病毒 AAV1-EF1a-DIO-mCherry。组织学分析证实了mCherry报告基因与DRN_VIP神经元的共定位。

手术后四周，研究人员首先在一系列行为测试中测试了焦虑、风险评估和运动参数的潜在变化。在焦虑相关行为或运动方面没有观察到差异，然而，EPM中受保护头部探视的百分比（风险评估的标志）在hM3D(Gq)小鼠中显著更高，表明与对照组相比风险评估增加。然后研究人员进行了VLT以研究小鼠对 looming 威胁的防御反应。hM3D(Gq)小鼠在第一天逃跑的次数显著多于对照小鼠，尽管由于对照组已经观察到的逃跑概率很高而存在平台效应。令人惊讶的是，hM3D(Gq)小鼠第一天的逃跑潜伏期高于对照小鼠，并且两组沿着天数趋向于相反的方向演变。在逃跑期间的最大速度方面，hM3D(Gq)小鼠和对照组之间没有观察到差异。与Casp3小鼠相反，研究人员在庇护所或触发区花费的时间或累积不动性方面没有观察到差异。第一天适应期间移动的距离也没有受到影响。总体而言，DRN_VIP神经元的化学遗传学激活对hM3D(Gq)小鼠的防御行为产生了与在Casp3小鼠中观察到的相反的效果。

^2.9DRN_VIP神经元对于控制睡眠稳定性和协调风险评估及防御反应至关重要

为了系统评估DRN_VIP神经元消融后的行为变化，研究人员计算了多个测试的z分数，将行为分类为睡眠稳定性、防御行为、风险评估、焦虑和运动。有趣的是，Casp3小鼠 specifically在活动期表现出NREM睡眠显著增加，但在非活动期没有。此外，它们表现出防御行为减少以及风险评估增加。然而，尽管EPM中开放臂时间减少，但在焦虑相关行为方面没有发现显著差异，运动方面也没有差异。总之，这些发现表明DRN_VIP神经元在控制睡眠稳定性和平衡威胁评估与防御反应方面起着关键作用，确保对视觉威胁的适应性反应。

研究结果表明，DRN_VIP神经元可能充当神经元警报系统，对威胁或意外刺激做出反应——例如来自同笼伙伴的运动或噪音——这些更可能在活动期发生。通过保持NREM睡眠发作短暂，这些神经元可以确保在环境干扰最频繁时保持高度警觉。因此，在它们缺失的情况下，睡眠稳定性 specifically在活动期增加，而不影响整体的稳态睡眠需求。

^2.10DRN_VIP神经元在行为小鼠中被视觉威胁预测线索激活

为了研究DRN_VIP神经元在视觉 looming 测试中被激活的具体时刻，研究人员在视觉 looming 行为任务期间记录了DRN_VIP→ovBNST末端水平的钙变化。研究人员在Vip-Cre小鼠的DRN中注射了AAV1-EF1a-DIO-GCaMP7f，并在右侧ovBNST植入了一根光纤。用于光纤光度测定实验的VLT场地和视觉 looming 线索协议与Casp3和hM3D(Gq)实验使用的相同。组织学分析证实了GCaMP7f在DRN_VIP神经元中的转染以及光纤的正确定位。

在ovBNST记录的光纤光度测定信号在 looming 线索期间显著增加，特别是在线索开始后3至6秒。这个时期对应于视觉 looming 线索大小快速增加1400%的时刻。当将光纤光度测定信号以逃跑开始为中心时，研究人员观察到在逃跑开始之前有一个峰值，以及在逃跑之后有一个较长的信号增加期。第一个峰值的时间表明DRN_VIP→ovBNST神经元在警觉性中起作用。

³讨论

在陌生、复杂或危险的环境中评估风险并选择适当的行为反应以减轻潜在威胁对于动物生存至关重要，并且可能受到稳态睡眠压力的影响。本研究对中脑多巴胺能VIP表达神经元群体进行了全面分析。研究结果表明，在小鼠和灵长类动物中，VIP表达神经元代表了腹侧水管周围灰质和背侧中缝核区域内DA神经元的重要亚群。在小鼠中，这群大约500个DRN_VIP神经元，占所有DRN_DA神经元的40%，位于西尔维乌斯水管下方的蟹钳状区域，占据0.155立方毫米的体积。这个特定的神经元群体战略性地位于通过反馈回路调节中央延伸杏仁核。它主要接收来自ovBNST和CeA（外侧部分）中PKC-δ神经元的输入。反过来，DRN_VIP神经元将轴突投射回ovBNST和CeA（外侧部分），在那里它们通过释放谷氨酸调节PKC-δ神经元活动。DRN_VIP神经元的选择性基因消融导致几个关键效应：1）BNST和CeA的电生理活动增加；2）活动期睡眠结构破坏，其特征是NREM发作频率减少和持续时间增加，这表明睡眠稳定性增强，而总NREM睡眠时间没有增加，也没有过度白天嗜睡；3）可能反映功能失调处理的风险评估行为增强；4）防御反应改变。研究人员进行了光纤光度测定实验，在BNST水平监测DRN_VIP神经元轴突末端的活动。这种方法证明了在行为小鼠呈现视觉威胁预测线索期间，DRN_VIP系统被直接激活。这些发现为了解控制睡眠稳定性和正常生理条件下风险评估行为的神经环路提供了宝贵的见解。

^3.1DRN_VIP神经元通过反馈环路战略性地位于影响中央延伸杏仁核

研究表明，DRN_VIP神经元是小鼠DRN_DA神经元的关键亚群，也存在于非人灵长类动物中，从而提示了潜在的进化保守性。研究发现DRN_VIP神经元主要投射到CeA和BNST。研究结果进一步揭示，背外侧BNST（包括ovBNST和囊旁BNST）、前BNST和CeA（外侧部分）是DRN_VIP神经元的主要靶区域，其次是岛叶皮质和后基底外侧杏仁核。原位杂交结果表明，DRN_VIP神经元可以被分类为DRN_DA神经元的亚群，因为它们在超过80%的情况下与Th mRNA共定位。根据它们的分子谱，在背侧DRN内已经鉴定出三个不同的多巴胺能神经元亚群。研究结果进一步证实了这种异质性，并揭示DRN_VIP神经元占DRN中多巴胺能神经元总数的40%。将DRN_VIP神经元分类为多巴胺能神经元一直是近期争论的话题。小鼠中的观察表明，这些神经元在DRN内表现出低水平的TH蛋白，如弱免疫组织化学标记所证明。相比之下，TH表达在它们轴突末梢的BNST和CeA中更为突出，在Casp3组中观察到标记明显（约50%）且显著减少。这种模式在非人灵长类动物中似乎不成立，其中DRN_VIP神经元在DRN本身内显示出强大的TH表达。

虽然TH表达水平与多巴胺神经元合成和释放多巴胺的能力之间存在明确