肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占绝大多数。肿瘤细胞依赖有氧糖酵解（Warburg效应）维持快速增殖，靶向这一代谢特征已成为抗癌治疗的新策略。丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）是调控糖代谢平衡的关键酶，其过度表达会导致丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）失活，从而促进糖酵解。尽管PDK1抑制剂如DCA（二氯乙酸）已进入临床评估，但其疗效有限，且具体分子机制尚未完全阐明。因此，开发新型PDK1抑制剂并揭示其作用机制具有重要临床意义。
近期，一种基于2,2-二氯苯乙酮（DAP）结构优化得到的新型PDK1抑制剂"64"在NSCLC模型中展现出强效抗癌活性，但其诱导细胞凋亡的详细通路及潜在抵抗机制仍不明确。为解决这一问题，澳门大学健康科学学院的研究团队在《Translational Oncology》上发表了最新研究，系统阐述了"64"通过ROS/AMPK/MAPK轴诱导凋亡的机制，并首次发现NF-κB激活作为PDK1抑制后的代偿性生存信号。
研究采用NCI-H1975和NCI-H1650两种NSCLC细胞系，通过Western blot、线粒体/细胞质分离、JC-1染色、流式细胞术等技术评估凋亡相关蛋白表达、线粒体膜电位（MMP）和活性氧（ROS）水平。RNA测序（RNA-seq）和实时荧光定量PCR（qPCR）用于分析信号通路变化，联合指数（CI）计算验证药物协同效应。
64影响凋亡通路关键蛋白
Western blot结果显示，"64"剂量依赖性增加cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved PARP/PARP比值，证实其激活caspase依赖性凋亡。线粒体与细胞质分离实验表明，"64"处理显著促进细胞色素C（CytC）从线粒体释放至胞质，触发凋亡级联反应。
64通过ROS抑制NSCLC生长并诱导凋亡
使用ROS清除剂NAC（N-乙酰半胱氨酸）验证了"64"的效应依赖于ROS生成。MTT法显示"64"显著抑制细胞活力，JC-1染色和Annexin V/PI双染证明其诱导MMP去极化和细胞凋亡，而NAC预处理可逆转这些现象。
64通过ROS激活AMPK和MAPK通路
Western blot分析表明，"64"剂量依赖性增强AMPK、p38 MAPK、JNK和c-Jun的磷酸化水平，且NAC能抑制这一激活，说明ROS是上游调控因子。
64通过ROS影响NSCLC凋亡通路
联合NAC处理减弱了"64"引起的CytC释放、Bax上调和Bcl-2下调，以及caspase-9、caspase-3和PARP的切割，进一步确认ROS在凋亡通路中的核心作用。
64通过p38 MAPK激活NF-κB通路
RNA-seq和qPCR显示"64"上调NF-κB通路基因（如MAP3K14、BIRC3、NF-κB2、RelB）。核质分离实验表明p65核转位增加，且p38 MAPK抑制剂SB203580可抑制该现象，说明p38 MAPK是NF-κB激活的上游介质。
NF-κB激活挽救64诱导的凋亡
NF-κB抑制剂JSH-23与"64"联用显著增强细胞活力抑制、MMP去极化和凋亡率。联合指数（CI）分析显示协同效应（CI<1）。Western blot进一步证实联用组Bax/Bcl-2比值升高，caspase-3和PARP切割增强。
NF-κB通路调控64对凋亡蛋白的影响
JSH-23联合处理加剧了CytC的线粒体释放，并增强JNK和c-Jun磷酸化，表明抑制NF-κB可通过JNK通路强化凋亡。
研究结论表明，PDK1抑制剂"64"通过ROS积累激活AMPK/MAPK通路，诱导线粒体依赖性凋亡，同时触发p38 MAPK介导的NF-κB活化作为代偿性生存机制。联合NF-κB抑制剂可阻断这一抵抗信号，增强JNK介导的凋亡。该研究不仅揭示了PDK1抑制剂的分子机制，还为NSCLC的代谢靶向治疗提供了联合用药新策略。
