人脑类器官在自体星形胶质细胞支持环境中模拟肿瘤发生与浸润的研究

为解决脑肿瘤研究缺乏合适模型的难题，研究人员利用人脑类器官过表达c-MYC构建自体肿瘤模型，发现星形胶质细胞支持肿瘤细胞浸润，X射线照射可显著抑制肿瘤细胞侵袭。该模型为评估癌症治疗策略提供了重要平台。

脑肿瘤，特别是恶性胶质瘤和儿童脑肿瘤，一直是肿瘤治疗领域的重大挑战。尽管在外科手术、化疗、免疫治疗和放射治疗等方面进行了广泛研究，但许多脑肿瘤类型的有效治疗选择仍然有限。例如，胶质母细胞瘤患者的中位生存期仅约15个月，而儿童患者对大多数标准治疗反应不佳。这种治疗困境很大程度上源于缺乏能够准确模拟人脑肿瘤生物学特性的研究模型。

传统的研究模型存在明显局限性：二维培养的肿瘤细胞单层无法模拟三维环境中的肿瘤浸润行为；细胞系在传代过程中会出现克隆选择和遗传变异，降低其生理相关性；动物模型则因物种差异在遗传背景、形态结构、解剖学和代谢状态等方面无法准确重现人类情况。虽然患者来源的类器官（PDOs）在一定程度上保留了肿瘤特性，但长期培养会导致肿瘤异质性丢失。近年来，人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）衍生的脑类器官为模拟人脑肿瘤提供了新希望，但如何建立能够长期研究、且能模拟肿瘤与正常组织交界相互作用的模型仍是一个挑战。

在此背景下，Esther Schickel等研究者在《iScience》上发表了他们的最新研究成果。他们通过建立一种可重复的脑类器官肿瘤模型，在自体环境中模拟脑肿瘤发生过程，并成功应用于放射治疗研究。该研究结合了睡美人转座子系统（Sleeping Beauty transposon system）介导的c-MYC癌基因过表达、类器官切片气液界面（air-liquid interface, ALI）培养技术和细胞共培养策略，创建了一个能够模拟肿瘤发生、浸润和治疗反应的平台。

研究人员采用了几项关键技术：使用人胚胎干细胞系WA09-FI（H9）生成脑类器官；通过睡美人转座子系统在类器官中过表达c-MYC癌基因并共表达GFP标记；利用荧光激活细胞分选术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分离GFP⁺/c-MYC^high细胞；建立类器官切片ALI培养系统以实现长期培养；构建组配体（assembloids）模型和共培养系统模拟肿瘤-正常组织界面；应用X射线照射研究放射治疗反应；采用单核RNA测序（single nuclei RNA sequencing, snRNA-seq）和免疫荧光分析等技术进行多维评估。

脑类器官展现从增殖到成熟的动态转变过程

研究人员首先证实了脑类器官在培养过程中呈现明显的动态变化。类器官大小在培养初期（约50天内）持续增加，这与Ki-67阳性细胞的高增殖活性相一致。50天后，类器官大小趋于稳定，Ki-67信号显著减少。不同细胞类型在类器官中同时存在，但其特异性标志物的蛋白表达和空间分布随类器官年龄而变化。

早期祖细胞标志物巢蛋白（nestin）在约25天时遍布整个类器官，而100天后主要分布在类器官外围。神经元标志物MAP2和DCX在50天前即可检测到，表达峰值出现在50天左右，之后略有下降，并主要定位于类器官外围。轴突标志物SMI312的表达强度在50天左右开始增加，100天后继续增强但无显著进一步增加。

星形胶质细胞的增加（通过GFAP表达指示）始于100天左右，持续到150天，主要分布在类器官外围。星形胶质细胞中高表达的间隙连接蛋白CX43也呈现相似表达模式，但在75天左右就开始增加，150天达到平台期。突触前标志物VAMP2和SYN1在100-125天的类器官中定位于神经元细胞（SMI312⁺或MAP2⁺）附近，而星形胶质细胞（GFAP⁺）也分布在此区域。突触前标志物SYN1与突触后标志物PSD95在空间上紧密相邻，表明功能连接的形成。

脑类器官和类器官切片是具有脑样特征的稳健模型

随着类器官尺寸增大，其内部会出现细胞死亡，表现为DAPI染色中核收缩和碎片化，以及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放增加。这很可能是由于氧气和营养物质供应不足所致。相比之下，切成300μm厚切片并在ALI条件下培养的类器官显示大部分完整的细胞核，细胞外LDH显著少于同龄全类器官，同时保持了原有的3D结构。

100天时，全类器官和类器官切片中增殖细胞（Ki-67⁺）的丰度均较低，两者相当。两种培养系统中凋亡（通过活性caspase-3染色证明）的发生率都非常低。ALI培养的类器官切片显示出从切片主体延伸出的轴突束，这些轴突束随时间的推移宽度和大小不断增加。类器官切片可维持100天以上，并继续显示脑样特征，包括动态和有组织的轴突网络。

SMI312染色显示，类器官切片中轴突纤维沿多个不同方向取向，而与年龄匹配的全类器官中观察到的方向性很少形成对比。CX43染色进一步证实了细胞间网络的存在。100天时，类器官和类器官切片呈现异质性细胞组成，包括胶质前体细胞（GLAST⁺和PDGRα⁺）、神经元（MAP2⁺）以及放射状胶质细胞和成熟星形胶质细胞（GFAP⁺）。

单核RNA测序分析显示，全类器官和类器官切片中几乎所有细胞群都表达核心祖细胞标志物CHD7，但类器官切片显示出增强的神经元和少突胶质细胞成熟（RBFOX3, MBP）。全类器官保留了更多的放射状胶质细胞和早期祖细胞标志物（FABP7, ID2/ID4）。CAMK2A和RBFOX3提示皮质神经元身份并定义兴奋性神经元成熟，其中CAMK2A主要在类器官中表达，而RBFOOX3在类器官切片中表达。

尽管类器官切片中MBP在mRNA水平的表达显著高于类器官，但其蛋白表达在两种模型系统中都较低，表明髓鞘形成仍处于早期阶段。尽管如此，在钙信号记录中观察到了类器官切片中细胞的自发活动。ALI培养使长期培养超过一年成为可能。

遗传修饰的脑类器官细胞显示肿瘤样特性

为生成可重复的肿瘤模型，研究人员首先优化了核转染程序（包括质粒浓度和核转染方案）。用携带睡美人转座酶和c-MYC癌基因以及GFP的载体核转染类器官后，在核转染后1周内首次出现GFP⁺细胞，在大多数情况下，它们相对快速地过度生长类器官，这通过培养期间GFP信号的增加得到证明。

核转染的随机性导致类器官间MYC过表达的高度变异性，表现为不同类器官间GFP信号强度的差异。为提高实验的可重复性，研究人员基于共表达GFP的存在，通过FACS从核转染的类器官中分离遗传修饰细胞。这些细胞可传代和/或冷冻保存用于扩增和/或后续使用。

M-FISH分析显示，302个GFP⁺/c-MYC^high细胞与198个对照H9细胞相比，两组均无克隆性畸变。这些GFP⁺/c-MYC^high细胞表现出高增殖能力（Ki-67⁺）和未成熟表型（Sox2⁺），在一定程度上表达轴突蛋白（用SMI132标记），几乎检测不到胶质祖细胞标志物PDFGRα的表达。此外，它们还显示侵袭性（VIM⁺）和迁移特性（划痕实验）以及（癌症）干细胞样表型（CD133⁺）。

RT-qPCR分析比较了未核转染对照、核转染类器官和分离的GFP⁺/c-MYC^high细胞中的mRNA水平，结果显示核转染类器官和分离的GFP⁺细胞中c-MYC表达显著增加。与对照类器官相比，GFP⁺细胞在mRNA水平上显示TP53、MKI67、PROM1、GLS和SNAI1表达显著增加。然而，对照和核转染类器官之间这些标志物的表达没有变化。与对照类器官和GFP⁺细胞相比，核转染类器官中肿瘤抑制标志物NF1和PTEN的表达显著降低。相反，GFP⁺细胞与对照类器官相比，NF1和PTEN的表达没有显著差异。

脑类器官和类器官切片作为自体肿瘤样细胞的支架

为提高肿瘤模型的可比性和可重复性，研究人员将GFP⁺/c-MYC^high细胞聚集成球并与正常姐妹类器官融合形成组配体（assembloids）。融合后第9天，组配体内的肿瘤球部分与单独培养的肿瘤球相比显示出增加的细胞密度。通过融合，肿瘤球的GFP⁺/c-MYC^high细胞与来自类器官外围的星形胶质细胞（GFAP⁺）和神经元（MAP2⁺）接触。

观察到星形胶质细胞（GFAP⁺）的突起从相互作用部位扩展到肿瘤球中，而神经元（MAP2⁺）的这种情况观察较少。反过来，来自肿瘤球的GFP⁺细胞显示出浸润到类器官中的能力。GFP⁺/c-MYC^high细胞从球体的浸润潜力通过类器官中GFP信号和IF染色得到证实，特别是在球体-类器官界面处，在类器官较深区域观察到少量GFP⁺/c-MYC^high细胞。此外，单个迁移的GFP⁺细胞似乎与星形胶质细胞（GFAP⁺）密切相互作用，星形胶质细胞用其突起包围它们。

在类器官切片与添加到切片顶部的单个肿瘤样细胞的共培养中，研究人员观察到GFP信号随时间增加，导致类器官切片过度生长。GFP⁺/c-MYC^high细胞主要分布在切片中GFAP和GLAST表达增加的区域附近，尽管信号之间没有或只有很少共定位。尽管GFP⁺细胞靠近神经元标志物（SMI312和MAP2）表达增加的区域，但它们通常与这些区域空间分离。此外，在类器官切片的较深层也观察到GFP⁺细胞，证实了它们的浸润潜力。

两种肿瘤模型中的细胞保留了增殖和未成熟特性，通过c-MYC过表达和MKI67表达增加以及MAP2和GFAP表达减少得到证明。与各自对照相比，共培养中TP53表达较高，而两种肿瘤模型中NF1和PTEN表达均低于正常类器官或切片。这反映了整个核转染类器官中的情况。与GFP⁺细胞中的表达相反，与对照相比，共培养中PROM1表达降低。对照和共培养之间GLS表达没有明显差异，而上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）的主调控因子SNAI1在共培养中表达增加，但在组配体中未增加。

批量RNA测序数据显示，全类器官和类器官切片与肿瘤细胞和球体聚类相距较远，而组配体代表介于两者之间的第三个聚类。批量RNA测序还显示了支持肿瘤细胞存活、侵袭和EMT的额外因子在模型系统中的表达。例如，神经元迁移的关键调控因子RELN主要在正常脑切片和类器官中表达，但在共培养中基本缺失，Reelin信号轴的其他成员包括DAB1、VLDRL和SRC也类似。已知的促存活因子SERPINE1在对照类器官和组配体中表达，在类器官切片中表达较少，但在肿瘤球体和分离的肿瘤样细胞中显著检测不到。

促进神经元成熟和可塑性的脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）在全类器官和类器官切片中表达，在组配体中观察到水平降低，在肿瘤样细胞和肿瘤球体中表达更低。相反，与促肿瘤效应相关的神经生长因子（nerve growth factor, NGF）在肿瘤球体和肿瘤样细胞中表达，在组配体中表达较低。虽然肿瘤样细胞显示低SRC、SRCIN1和DAB2IP表达，但SLA主要在这些细胞中表达。金属蛋白酶ADAM15和MMP2在肿瘤样细胞和肿瘤球体中有一定程度表达，但在正常类器官和类器官切片中显著缺失。两种肿瘤模型显示细胞培养介质中与细胞死亡/坏死相关的LDH水平显著高于各自对照。

脑类器官和类器官切片对X射线照射的反应

鉴于c-MYC在各种脑肿瘤类型中的广泛存在及其在介导治疗干预反应中的作用，研究人员进行了初步照射实验，以评估基于GFP⁺/c-MYC^high肿瘤样细胞的肿瘤模型的行为——使用上述两种不同培养方法生成。

c-MYC mRNA在脑类器官和类器官切片中几乎检测不到，但在肿瘤球体、正常类器官与肿瘤球体的组配体以及与GFP⁺/c-MYC^high肿瘤样细胞共培养的类器官切片中高表达。照射导致接受3 Gy X射线照射后7天的组配体中c-MYC mRNA水平显著降低，以及与肿瘤样细胞共培养的类器官切片接受15 Gy X射线照射后20天与假照射对照相比显著降低。

照射后，全类器官或类器官切片中GFAP mRNA水平保持不变。然而，与假照射对照相比，3 Gy或15 Gy X射线照射导致组配体或与GFP⁺/c-MYC^high肿瘤样细胞共培养的类器官切片中GFAP mRNA表达显著增加。

与照射导致细胞死亡/坏死增加的预期相反，研究人员在全类器官照射后2天或正常类器官切片照射后20天未观察到细胞外LDH水平作为辐射诱导坏死指示的显著变化。肿瘤球体在照射后响应急性（2天）细胞外LDH水平增加，而共培养在照射后20天显示LDH释放较各自假照射对照减少。

照射后7天，GFP⁺/c-MYC^high肿瘤样细胞浸润到组配体类器官部分的深度显著降低。特别是在假对照中观察到的迁移到类器官组织深处的细胞在照射样品中缺失。

研究结论与意义

这项研究成功建立了一个稳健且可重复的自体脑肿瘤模型系统，通过两种不同的培养方法实现了可适应的肿瘤起始步骤（即引入其他癌基因和肿瘤抑制基因），能够长期研究各种治疗方式，如放射治疗、化疗和免疫治疗，以及治疗响应下肿瘤和正常细胞在肿瘤边缘的精确相互作用。这种方法确保所有细胞来自相同的遗传背景，为治疗评估提供了更准确和个性化的平台。

该研究的创新之处在于：首次在自体环境中利用脑类器官过表达c-MYC构建脑肿瘤模型；开发了类器官切片ALI培养系统实现长期无坏死培养；建立了组配体和共培养两种模型模拟肿瘤-正常组织界面；证实了星形胶质细胞在支持肿瘤细胞浸润中的关键作用；验证了X射线照射对肿瘤细胞杀伤和浸润抑制的有效性。

然而，该模型也存在一些局限性：类器官中少突胶质细胞数量较少，髓鞘形成仍处于早期阶段；系统缺乏血管化和大脑固有免疫系统（小胶质细胞）等重要组成部分。这些限制可以通过协议改进来解决，例如应用 Yan 等人建议的方案 alterations 来增加少突胶质细胞数量，或通过体内异种移植方法实现血管化的免疫competent环境。

尽管存在这些限制，该研究建立的脑类器官肿瘤模型为脑肿瘤研究提供了强有力的工具，特别是在研究肿瘤微环境中各种细胞类型的相互作用、肿瘤浸润机制以及治疗响应方面具有重要意义。未来通过引入在儿童胶质母细胞瘤中常见影响的肿瘤抑制基因缺失，并进行单细胞分析，将进一步 refine 该模型，为个性化癌症治疗研究提供更强大的平台。