茉莉素与生长素途径协同调控及上部茎源生长素输入在两种矮牵牛属植物不定根形成中的重要作用

本研究通过基因组测序的腋花矮牵牛和胀果矮牵牛，结合植物激素靶向微阵列、RT-qPCR和LC-MS/MS技术，系统揭示了切割 excision 触发的茉莉酸 JA 和生长素 auxin 通路在茎基部的协同作用机制，并证实上部茎叶来源的生长素流入对不定根 AR 形成至关重要，为园艺作物无性繁殖的分子调控网络提供了新见解。

两种矮牵牛属植物的生根能力差异及其对供体植株因素的依赖性

腋花矮牵牛（Petunia axillaris）和胀果矮牵牛（Petunia inflata）均能高效生根，在切割后16至18天即可形成不定根（Adventitious Roots, ARs），且无需外源生长素。然而，综合八次独立实验的结果表明，P. inflata在平均根数、平均根长和总根长方面均显著高于 P. axillaris。P. inflata每株插条至少产生6条根，总根长至少5厘米，而 P. axillaris的最小根数和总根长分别为1条和0.5厘米，表明 P. inflata具有更高的生根能力。值得注意的是，在某些实验中，P. axillaris也表现出较强的生根能力，这提示生根能力不仅受遗传控制，还可能受到供体植株生理状态（如光照、温度、植株年龄）的影响。尽管如此，总体数据支持 P. inflata具有更高的生根潜力。

茎基部生根诱导早期茉莉酸通路的激活及其与ERF家族的关联

利用植物激素靶向微阵列对茎基部转录组的分析显示，切割 excision 后最早的反应之一是茉莉酸（Jasmonic Acid, JA）生物合成和信号通路相关基因的上调。在切除后0.5小时（hours post excision, hpe），控制JA生物合成的基因，如脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧化物合酶（AOS）、丙二烯氧化物环化酶（AOC）和12-氧代植物二烯酸还原酶（OPR）家族基因在两种物种中均被上调，并在2 hpe达到或接近峰值。与此相一致，茎基部JA及其生理活性异亮氨酸共轭物JA-Ile的浓度在0.5 hpe出现瞬时积累峰值，随后下降。尽管 P. axillaris的JA峰值水平更高，但JA-Ile在两种物种中达到了相似的峰值。JA信号通路的早期响应基因JAZ（Jasmonate ZIM-domain）在 P. inflata的茎基部和上部茎中表现出更强且更持久的激活，表明 P. inflata的JA信号转导更为增强。这种JA通路的早期激活是典型的伤口反应，并与不定根形成呈正相关，这与在拟南芥下胚轴中JA抑制不定根形成的作用相反，支持了JA在插条生根中的积极调控作用。

与JA通路激活同步，乙烯响应因子（Ethylene Response Factor, ERF）家族基因在茎基部表现出频繁且强烈的上调，始于0.5 hpe。两种物种均局部上调了ERF1、ERF2、ERF5、ERF13、ERF17和ERF25等同源基因。特别值得注意的是，P. axillaris从24 hpe起在茎基部强烈上调ERF114，而 P. inflata则在2至72 hpe期间局部上调其近缘同源基因ERF113，并在24 hpe时在所有上部切割部位（除茎尖外）均有上调。在拟南芥中，ERF113和ERF114受JA、水杨酸（Salicylic Acid, SAL）、脱落酸（ABA）和乙烯诱导，参与伤口响应和暗处理诱导的不定根形成。这些结果表明，早期ERF基因（尤其是ERF113/ERF114）的上调可能作为JA和乙烯的下游，并作用于生长素的上游，从而促进不定根诱导。

早期局部ILR/ILL基因上调和PINOID介导的细胞内生长素分布重排对茎基部生长素稳态的贡献

在生长素相关类别中，差异表达基因（DEGs）数量最多。与拟南芥叶外植体不定根形成过程中YUCCA基因上调不同，两种矮牵牛物种的茎基部显示控制生长素生物合成的基因，特别是YUCCA家族基因，主要被下调。然而，两种物种均表现出IAA-亮氨酸抗性样（IAA-leucine-resistant-like, ILR/ILL）基因的快速且强烈上调，尤其是ILR1-like2和ILR1-like6，P. axillaris还额外上调了ILR1-like4。ILR/ILL基因编码生长素共轭物水解酶，在拟南芥中可被伤口和JA诱导，不仅能水解IAA-氨基酸共轭物释放游离IAA，还可能通过水解JA-Ile来减弱JA信号。这表明ILR1-like2、ILR1-like4和ILR1-like6的早期上调可能有助于2 hpe时IAA的增加以及同时期JA-Ile的减少，从而影响不定根形成。

此外，两种物种在0.5 hpe时均下调了一个与烟草PINOID基因A4A49_10797高度同源的基因（属于PINOID/WAG1/WAG2家族）。PINOID丝氨酸/苏氨酸激酶通过磷酸化PIN蛋白调控其胞内极性定位。在拟南芥中，pid14 wag1 wag2三突变体严重抑制了暗处理幼苗的不定根形成。这表明该同源基因的早期下调可能通过影响PIN蛋白的磷酸化状态，增强生长素的向基性运输，从而将生长素导向不定根创始细胞。

P. inflata更高的生根能力得益于茎基部更高的生长素积累、更高的生长素/细胞分裂素比率以及生根诱导期间更强的生长素信号转导

生长素（IAA）浓度分析显示，在两种物种的茎基部，IAA在切割后直至2 hpe增加，随后下降，但 P. inflata的IAA浓度在整个观察期间（0-72 hpe）始终显著高于 P. axillaris（约3倍）。茎基部生长素转运蛋白基因的表达变化主要在24 hpe后检测到，其中PIN/PIN-like基因在 P. inflata中上调更为频繁，这表明转运蛋白基因调控可能是高IAA水平的结果而非原因。两种物种均在生根诱导期（24 hpe）上调PIN6，在根起始期（72 hpe）上调PIN5。仅在 P. inflata中观察到PIN-like1和/或PIN-like3基因的上调。在拟南芥中，PIN6定位于内质网和质膜，其过表达促进不定根形成，提示PIN6是矮牵牛不定根诱导的关键转运蛋白。

与更高的IAA水平一致，P. inflata在茎基部也表现出更强的生长素信号通路基因上调，包括编码生长素抑制蛋白的Aux/IAA基因和作为正调控因子的ARF（Auxin Response Factor）基因。特别值得注意的是，ARF11的同源基因在两种物种中均被强烈上调，而ARF9的同源基因则被下调。在拟南芥和番茄中，ARF11促进侧根形成，而ARF9抑制细胞分裂，这表明ARF11上调和ARF9下调的组合可能有利于不定根形成。

此外，LBD（Lateral Organ Boundaries Domain）家族基因对切割 excision 反应强烈，其上调基因的数量和强度在 P. inflata中均高于 P. axillaris。两种物种中，LBD41、LBD1和LBD16的同源基因均被持续上调。这些基因在其他植物中被证明在不定根形成中发挥重要作用，位于生长素信号下游。

P. inflata更高的生根能力可归因于其茎基部更高的IAA水平、更高的IAA/细胞分裂素比率（在2 hpe达到峰值）以及随之而来的更强生长素信号转导和下游响应。这一结论得到了外源IAA应用实验的支持：在生根诱导期（0-72 hpe）施用低浓度IAA（5-10 mg L^-1）对 P. axillaris生根的促进作用显著大于 P. inflata，表明 P. axillaris的内源IAA水平是其生根的限制因素。然而，在高浓度IAA（50-150 mg L^-1）下，P. inflata的生根反应更强，揭示了其更高的最大生长素响应能力。

两种物种的生根依赖于叶片来源的、PAT控制的生长素供应，该供应决定了叶-茎基部的生长素梯度，而P. inflata显然受益于叶片中PIN和PIN-like转运蛋白的更高转录

利用NPA（N-1-萘基邻氨甲酰苯甲酸）阻断极性生长素运输（Polar Auxin Transport, PAT）的实验表明，在基部叶片和上部茎段周围施用30 mg L^-1NPA几乎完全抑制了两种物种的不定根形成，证明来自上部切割部位（包括叶片）的生长素流入是两者生根的关键瓶颈。

激素分布分析显示，P. inflata在叶片、上部茎和茎基部之间存在更陡峭的IAA梯度。这种梯度与 P. inflata叶片中PIN5和PIN-like基因的独家上调相关。虽然内质网定位的PIN蛋白（如PIN5, PIN-like）传统上被认为可能通过隔离IAA来减少可用于信号转导和输出的游离IAA，但最近研究表明，PIN-like2的沉默会降低生长素响应基因表达并减少根数和根长，提示其积极作用。此外，bZIP转录因子TGA7可直接激活PIN-like2的启动子，而TGA因子是SAL信号通路的关键组分。

叶片水杨酸和细胞分裂素水平可能调控插条茎基部的叶片源生长素供应

相关性分析发现，叶片中异戊烯基腺嘌呤（Isopentenyladenine, IP）的水平与叶-茎基部IAA梯度呈负相关。细胞分裂素已知能调控PIN基因转录和PIN蛋白胞内运输。P. inflata插条叶片中的SAL水平显著高于 P. axillaris，且与叶-茎基部IAA梯度呈正相关。SAL对生长素运输和不定根形成的影响复杂，既有促进也有抑制的报道。结合上述TGA因子可能链接SAL信号与PIN-like基因表达的推测，P. inflata叶片中较低的IP水平和较高的SAL水平可能通过未知机制（可能涉及TGA转录因子激活PIN-like基因）共同促进生长素从叶片输出，从而形成更陡的IAA梯度，导致茎基部更高的IAA积累和更强的生根能力。

总结模型

该研究数据突出了两种矮牵牛物种在不定根诱导期间茎基部激素机制的协同激活。这一过程始于JA和ERF转录因子的激活，继而是生长素通路的作用，而生长素的积累强烈依赖于来自上部切割部位的生长素流入。

概念模型整合了这些关系：伤口触发茎基部早期JA积累，伴随JA生物合成基因（P. axillaris中OPR和AOC；P. inflata中LOX和AOS）的上调。JA-Ile通过COI1–JAZ共受体复合物被感知，反映在MYC2和JAZ表达升高上，P. inflata的JAZ上调更强，表明其JA响应更显著。多个伤口响应ERF基因（ERF1, ERF2, ERF5）在两种物种中均被诱导，而ERF113和ERF114则呈现物种特异性诱导。ERF和茉莉素通路可能与生长素通路相互作用。

在不定根诱导期间，PAT将IAA从上部部位向基运输至茎基部，叶片可能是重要的生长素源。独脚金内酯（Strigolactone, SL）生物合成基因CCD和D27的下调可能通过减少抑制性SL来促进生长素运输和IAA积累。P. inflata叶片中PIN5和PIN-like1/3的独家上调可能增强生长素输出，导致更强的向基性IAA运输和更陡的IAA梯度，这一过程受较高SAL和较低IP水平调控。因此，P. inflata表现出更高的IAA积累和IAA/细胞分裂素比率，有利于不定根诱导。此比率升高激活了调控IAA感知、信号转导和细胞响应的生长素信号基因，进而反馈调节IAA分布。PINOID（A4A49_10797）的下调可能有利于PIN蛋白的基部积累。P. inflata中Aux/IAA、ARF、GH3、PIN/PIN-like和LBD基因的更强诱导可能贡献于其相较于 P. axillaris更高的生根能力。ARF11和PIN6的局部上调、ARF9的下调以及P. inflata中PIN-like3的独家诱导提示这些基因在不定根诱导中的关键作用。两种物种中LBD1、LBD16和LBD41的上调支持其在生长素依赖性不定根形成中的功能。特定的ILR-like基因可能通过解共轭作用调控0.5 hpe后JA-Ile的下降，为不定根起始创造条件。

这些发现增进了对不定根形成激素调控机制的理解，并为利用农杆菌介导的转化和CRISPR/Cas突变技术进行候选基因的功能分析奠定了基础。