微小RNA（miRNA）是一类长度约为18–24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程中通过调节基因表达发挥关键作用[1]。miRNA的异常表达与多种疾病（包括癌症）密切相关。已有研究表明，miRNA-21在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌和前列腺癌等患者的血清中异常表达，并被公认为致癌miRNA[2]、[3]、[4]、[5]。miRNA通过外泌体、凋亡小体或蛋白质结合从癌细胞释放到血液中。由于其稳定性和可检测性，从血液中提取的miRNA已成为癌症研究中的关键生物标志物。作为无创检测方法，检测血液中的miRNA在早期筛查方面具有巨大潜力。准确识别和定量分析miRNA对于疾病诊断、治疗、探索其在特定生物通路中的作用以及相关药物开发具有重要意义。然而，由于miRNA序列较短、同源序列的干扰以及其在生物样本中的低丰度，其后续的准确识别和可靠分析受到严重限制。
目前，已经开发出多种方法用于准确检测miRNA的表达水平。Northern blotting是一种常见的miRNA检测方法，但其存在工作流程复杂、耗时较长和重复性较差等局限性[6]、[7]。作为miRNA检测的金标准，定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）具有高检测灵敏度，但其广泛应用受到引物设计挑战和高成本的限制[8]、[9]、[10]。微阵列检测作为一种高通量检测方法，效率较高，但仅限于半定量分析，操作过程复杂且检测成本较高[11]、[12]。近年来，一些等温核酸扩增技术（如指数扩增技术[13]、链置换扩增技术[14]、[15]、滚环扩增（RCA）[16]、催化发夹组装（CHA）和杂交链反应（HCR）[8]）受到了广泛关注。例如，Suo等人报道了两种基于CHA或HCR扩增策略的电化学生物传感器，显著提高了检测灵敏度[17]、[18]。
RCA是一种等温核酸扩增技术，利用环状DNA模板和链置换DNA聚合酶。在恒定温度条件下，引物与环状模板结合，使DNA聚合酶能够连续循环复制模板，生成由串联重复单元组成的长单链DNA产物。作为一种不依赖热循环的线性扩增方法，RCA消除了对复杂热循环仪器的需求，简化了操作流程并降低了检测成本。与传统PCR相比，RCA在等温条件下进行，机制更为简单，且不易发生非特异性扩增，特别适合用于即时诊断。通过合理设计环状模板，可以生成含有重复功能模块的RCA产物，便于构建多功能DNA纳米结构或作为多种信号标记的载体，从而显著扩展了其在多重检测和生物成像中的应用潜力。
目前，miRNA检测的生物传感器主要依赖于比色[19]、光学[8]和电化学[20]技术。其中，电化学生物传感器因其操作简单和成本效益而受到广泛关注。通过生物识别元件与其目标之间的高度特异性相互作用，电化学生物传感器能够产生易于读取的电信号，从而直接或间接实现对目标的定量分析。结合高灵敏度的信号放大技术，电化学传感器已成为miRNA检测的强大工具。
在RCA过程中，含有串联重复序列的线性DNA在聚合酶的作用下从环状DNA模板快速生成。在本研究中，我们首次开发了一种基于哑铃形DNA环（D-ring）RCA产物的3D DNA纳米球电化学生物传感器用于miRNA检测。目标miRNA作为一种有前景的非侵入性肿瘤生物标志物，与发夹捕获探针（HCP）的发夹结构结合并使其打开。暴露的粘性末端作为引物触发D-ring的RCA反应，形成DNA纳米球。3D DNA纳米球包含大量互补杂交序列，可实现超高的目标检测灵敏度。
