PSMA靶向巨噬细胞膜包覆纳米颗粒用于前列腺癌精准诊断与联合治疗
1 引言
前列腺癌(PCa)是全球男性最常见的恶性肿瘤。晚期前列腺癌侵袭性强、易转移，而现有的雄激素剥夺疗法和化疗存在耐药性问题，患者五年生存率低，亟需新型靶向治疗策略。纳米颗粒是靶向药物递送和癌症治疗的一种有前景的策略，但其强外源性和弱靶向性限制了应用。巨噬细胞膜包覆的纳米颗粒(MMCNPs)因具有免疫逃逸和肿瘤归巢特性而受到关注，但其归巢主要由趋化因子和粘附分子介导，缺乏特异性细胞识别。前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种II型跨膜蛋白，在低分化、转移性和激素难治性前列腺癌中高度过表达，是理想的分子靶点。
本研究设计了一种新型巨噬细胞膜包覆纳米颗粒P-MMCNPs，其外层为稳定跨膜表达PSMA单链抗体片段(gy1)的巨噬细胞膜，内层为Fe3O4@Au纳米颗粒(FeAuNPs)，并负载微管抑制剂美登素(DM1)。该设计旨在赋予纳米颗粒免疫逃逸和精准靶向能力，同时结合化疗与光热疗法(PTT)，以实现对前列腺癌的原发灶、转移灶乃至微转移灶的有效诊疗。
2 结果与讨论
2.1 P-MMCNPs的制备与表征
研究首先通过生物信息学分析证实PSMA在前列腺癌中特异性高表达。利用基因工程策略，将融合基因gy1-EGFP通过慢病毒感染Raw264.7细胞，成功构建了稳定跨膜表达PSMA单链抗体(gy1)的巨噬细胞系(Raw264.7gy-1-EGFP)，并通过流式细胞术和细胞ELISA验证了其与PSMA的结合活性。
采用超声挤出法将提取的Raw264.7gy-1-EGFP细胞膜包覆在预先合成的FeAuNPs核上，成功制备了P-MMCNPs。透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)显示FeAuNPs为均匀球形，并被细胞膜均匀包覆，形成了核壳结构。水合动力学直径和Zeta电位的变化也证实了包覆的成功。P-MMCNPs在模拟生理条件下具有良好的稳定性。研究还证实了P-MMCNPs中巨噬细胞膜蛋白和gy-1-EGFP融合蛋白的存在及其功能性结合活性。
P-MMCNPs作为药物载体表现出优异的DM1包封效率和负载能力。P-MMCNPs@DM1显示出谷胱甘肽(GSH)响应性的药物释放行为，这与前列腺癌细胞中GSH水平升高的特性相符。此外，P-MMCNPs在连续激光照射下表现出浓度和功率依赖的光热转换能力及优异的光热稳定性，并具有良好的MRI和CT成像能力，为其作为多功能诊疗平台奠定了基础。
2.2 P-MMCNPs的细胞靶向与内吞
流式细胞术和免疫荧光共聚焦实验表明，P-MMCNPs和其源细胞膜(MM)能够特异性结合PSMA阳性前列腺癌细胞(PC3PSMA+和LNCaP)，而对PSMA阴性的PC3PSMA−细胞无此作用。相比之下，仅表达EGFP的巨噬细胞膜制备的MMCNPs则无法区分PC3PSMA+和PC3PSMA−细胞。这证实了跨膜表达的gy1对增强P-MMCNPs的肿瘤靶向性和细胞摄取至关重要。
进一步研究发现，P-MMCNPs在15分钟内即可与PC3PSMA+细胞结合，并在30分钟内被细胞内吞，且内吞的纳米颗粒与溶酶体发生共定位。使用与gy1结合位点相同的全抗体PSMAb进行预孵育，几乎完全抑制了P-MMCNPs与PC3PSMA+细胞的结合/内吞过程，明确证实了P-MMCNPs的主动靶向能力是由gy1介导的。
2.3 P-MMCNPs的免疫学特性体外评价
巨噬细胞膜包覆的纳米颗粒可以继承源细胞的功能蛋白（如避免细胞吞噬的CD47），从而延长纳米药物在血液中的循环时间。通过罗丹明(Rho)标记实验，共聚焦显微镜和流式细胞术结果显示，与Rho-FeAuNPs（97.53%被吞噬）相比，Rho-P-MMCNPs被巨噬细胞的吞噬率显著降低至11.87%。这表明Raw264.7gy-1-EGFP膜包覆确实赋予了P-MMCNPs增强的免疫逃逸能力。
ELISA实验表明，P-MMCNPs预处理能显著降低肿瘤促进性细胞因子TGF-β、IL-4和IL-10的水平，显示出细胞因子中和能力。结果还显示，P-MMCNPs能极大抑制由细胞因子诱导的M2型巨噬细胞极化。这表明P-MMCNPs有潜力有效改善M2巨噬细胞相关的免疫抑制性肿瘤微环境。
2.4 P-MMCNPs在系统注射后对原发前列腺癌的主动靶向能力
在荷瘤小鼠模型中，通过负载PEG化的吲哚菁绿(ICG)进行荧光追踪，发现静脉注射ICG-P-MMCNPs后96小时，仍能在皮下PC3PSMA+肿瘤部位观察到强烈的荧光信号，而ICG-MMCNPs组在肿瘤部位的荧光信号几乎不可见。离体器官成像也证实了ICG-P-MMCNPs在肿瘤部位的显著富集。
除了荧光成像，基于P-MMCNPs的CT和MRI成像（包括MRI-T1WI正性成像和MRI-T2WI负性成像）均显示，P-MMCNPs能特异性且高效地增强肿瘤信号。共聚焦显微镜分析证实，P-MMCNPs被皮下肿瘤内的PC3PSMA+细胞特异性内吞。
药代动力学研究表明，P-MMCNPs@DM1在血液中的循环半衰期显著延长至10小时，与MMCNPs@DM1相似，而FeAuNPs@DM1的半衰期仅为3.0小时。这表明巨噬细胞膜包覆有效延缓了纳米颗粒从血液中的清除，且P-MMCNPs相对于MMCNPs增强的靶向能力与其半衰期无关。
2.5 P-MMCNPs对前列腺癌转移灶的主动靶向能力
研究进一步探索了P-MMCNPs主动靶向前列腺癌骨转移灶（晚期转移性前列腺癌患者的主要死因）的可行性。通过膝关节将PC3PSMA+-luc细胞注射到小鼠胫骨骨髓腔构建骨转移模型。静脉注射ICG-P-MMCNPs后，肿瘤部位的荧光信号在注射后1小时和12小时逐渐增强，而ICG-MMCNPs组的信号则迅速减弱。此外，ICG-P-MMCNPs还能有效识别骨转移旁直径仅3毫米的腹股沟微转移灶。离体胫骨转移灶成像也证实了P-MMCNPs出色的靶向能力。因此，P-MMCNPs具有诊断前列腺癌原发灶、转移灶和微转移灶的功能。
2.6 基于P-MMCNPs的纳米药物的体外抗肿瘤效应
细胞毒性实验(CCK-8)显示，P-MMCNPs@DM1对PC3PSMA+细胞具有显著的杀伤作用，而MMCNPs@DM1和FeAuNPs@DM1的杀伤作用中等或可忽略。P-MMCNPs@DM1对PC3PSMA+细胞表现出高度靶向的细胞毒性，其负载DM1的IC50为1.131 µg·mL−1；而非靶向的自由DM1对PC3PSMA+和PC3PSMA−两组的细胞毒性相当。与自由DM1相比，P-MMCNPs@DM1对PC3PSMA+细胞的细胞毒性较弱，分析认为自由DM1容易穿过细胞膜直接杀伤细胞，而P-MMCNPs@DM1需要经过PSMA结合、细胞内吞及后续药物释放才能发挥细胞毒性作用。
免疫荧光染色显示，P-MMCNPs@DM1处理后，PC3PSMA+细胞的微管蛋白受到严重破坏，细胞有丝分裂受到抑制。此外，P-MMCNPs对PC3PSMA+细胞表现出显著的光热消融功效。在接受激光照射后，P-MMCNPs@DM1（200 µg·mL−1P-MMCNPs负载1.2 µg·mL−1DM1）的细胞毒性得到进一步提高。综上，P-MMCNPs@DM1可以结合PTT和DM1化疗，进一步增强对前列腺癌细胞的杀伤效果。
2.7 P-MMCNPs@DM1的体内抗肿瘤效应
动物实验设计评估了P-MMCNPs@DM1的联合治疗效果。与PBS对照组肿瘤持续生长相比，其他四个治疗组（仅P-MMCNPs、P-MMCNPs+激光、P-MMCNPs@DM1、P-MMCNPs@DM1+激光）均显示出显著的肿瘤生长抑制。值得注意的是，仅注射P-MMCNPs（不含DM1和激光）就比PBS组显著抑制了肿瘤进展，这表明巨噬细胞膜介导的细胞因子中和和巨噬细胞极化重编程可能在体内发挥了抗肿瘤功效。
与未照射激光的P-MMCNPs@DM1组相比，DM1化疗与PTT的结合在整个治疗期间发挥了更强的抗肿瘤功效。进一步的比较研究也证实，在PC3PSMA+皮下异种移植模型中，P-MMCNPs@DM1能显著抑制肿瘤生长，而MMCNPs@DM1和FeAuNPs@DM1的抗肿瘤效果中等或可忽略。
Ki67免疫组化和TUNEL染色进一步支持了基于P-MMCNPs的纳米药物的优异抗前列腺癌功效。所有治疗方式，甚至仅使用P-MMCNPs，都强烈抑制了肿瘤细胞增殖并有效诱导了细胞凋亡。使用DM1和PTT的联合治疗显示出显著改善的抗肿瘤效果。
P-MMCNPs@DM1的主动靶向介导的抗肿瘤效应在前列腺癌骨转移模型中也得到证实。同样，DM1化疗和PTT的结合产生了最佳的治疗效果，经过21天治疗，转移性肿瘤被消除。此外，通过微型CT结果可见，有效治疗转移灶后，骨小梁微结构的破坏得到显著改善，肿瘤诱导的骨矿物质含量损失也得到恢复。荧光染色分析显示，与对照组相比，DM1和PTT联合治疗组中成骨细胞显著增加，破骨细胞显著减少，表明P-MMCNPs@DM1能有效抑制肿瘤诱导的骨破坏。值得注意的是，单独注射P-MMCNPs也显示出显著的抗肿瘤功效。因此，P-MMCNPs凭借其出色的PSMA靶向能力，在成功治疗原发性前列腺肿瘤、微转移灶及相关损伤方面展现出巨大潜力。
2.8 P-MMCNPs的体内抗肿瘤免疫调节作用
为了更深入了解P-MMCNPs在体内的抑制机制，研究进一步探究了其是否通过阻断M2巨噬细胞相关的肿瘤促进级联反应来发挥抗肿瘤作用。对肿瘤组织中巨噬细胞的免疫荧光染色显示，与PBS处理组相比，P-MMCNPs处理的肿瘤中M1/M2巨噬细胞比例发生了显著逆转。流式细胞术分析也检测到，与PBS对照组相比，P-MMCNPs治疗后，肿瘤组织悬液中CD80/CD86标记的M1巨噬细胞显著增加，而CD163/CD206标记的M2巨噬细胞显著减少。
ELISA检测显示，PBS处理的肿瘤中促瘤细胞因子IL-4、IL-10和TGF-β的含量更高，而在P-MMCNPs处理组中这些因子被显著抑制。同时，与M1相关的抗肿瘤细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α在P-MMCNPs处理的肿瘤中升高。这些结果表明，P-MMCNPs可以将巨噬细胞从M2表型重编程为M1表型，并中和促瘤细胞因子，从而有效地将肿瘤微环境调节为抗肿瘤状态。
研究进一步探讨了P-MMCNPs抑制肿瘤血管生成和上皮-间质转化(EMT)过程的潜力。结果显示，与PBS组相比，P-MMCNPs处理后，VEGFC表达下调，肿瘤血管生成标志物VEGFR2和CD105显著减少，EMT相关蛋白vimentin和E-cadherin发生显著逆转，表明P-MMCNPs在有效阻止肿瘤进展方面具有强大潜力。
2.9 P-MMCNPs基纳米制剂的安全性评价
通过血清学测试、组织形态学染色等手段，全面评估了P-MMCNPs和P-MMCNPs@DM1在正常或妊娠C57小鼠体内的主要毒性。结果显示，在连续两周静脉注射P-MMCNPs或P-MMCNPs@DM1后，所有处理组小鼠均未检测到明显的生理异常或全身毒性，外周器官、神经系统和胚胎发育也未观察到组织形态学异常。这表明P-MMCNPs可以作为肿瘤治疗的安全优异平台。
3 结论
本研究展示了一个有前景的多功能平台P-MMCNPs，用于PSMA靶向的多模态成像和联合治疗。该研究的创新点包括：首先，采用基因工程策略，使肿瘤特异性配体跨巨噬细胞膜直接表达，从而使膜包覆的P-MMCNPs获得了免疫逃逸能力和肿瘤靶向效率。其次，P-MMCNPs的载药能力高度灵活，可封装多种功能组分。第三，P-MMCNPs@DM1展现出强大的PSMA靶向多模态成像能力，并整合了DM1化疗和PTT的联合抗肿瘤效应，能够成功治疗原发性和转移性前列腺肿瘤，且未引起明显的全身毒性。第四，P-MMCNPs本身可以将巨噬细胞从M2表型重编程为M1表型，并中和促瘤细胞因子，从而有效调节肿瘤微环境至抗肿瘤状态。
总之，这项研究证明创新的P-MMCNPs是一个多功能平台，可用于提高前列腺癌靶向诊断和治疗效果并避免副作用。此外，它有望扩展到其他疾病的诊断和治疗中，具有临床转化潜力，并为整合基于纳米医学的靶向治疗与免疫调节提供了新见解。
4 实验部分
（此部分详细描述了细胞培养与慢病毒感染、细胞ELISA、膜提取、P-MMCNPs制备、表征、体外药物负载与释放特性评估、光热转换评估、特异性结合测定、共聚焦显微镜成像评估细胞靶向与内吞、体外免疫逃逸测定、细胞因子中和与巨噬细胞极化、动物模型构建、体内荧光成像、MRI/CT成像、循环半衰期检测、IC50测定、微管蛋白染色、体内联合抗肿瘤效应、Ki67和TUNEL染色、胫骨微结构分析、巨噬细胞相关切片染色、ELISA检测巨噬细胞相关细胞因子、qRT-PCR检测、P-MMCNPs器官毒性评价以及统计分析等具体实验方法。）
