引言
在21世纪现代医学取得巨大进步的背景下，人们对于天然疗法的兴趣与日俱增。植物疗法因其通常具有更好的耐受性和较低的副作用风险而受到青睐。罗伯特老鹳草（Geranium robertianum L.），又称汉荭鱼腥草，是一种在传统医学中用于治疗多种系统性疾病、极具治疗潜力但尚未被充分研究的药用植物。它属于牻牛儿苗科，广泛分布于欧亚及北美等地。传统上，其浸剂和煎剂用于治疗消化系统疾病、扁桃体炎、炎症及多种慢性病。现代研究已初步认识到其抗氧化、抗菌、抗炎、抗糖尿病、神经保护、抗癌和利尿等多种药理活性。本研究旨在对通过超声辅助提取获得的罗伯特老鹳草70%乙醇提取物（GR）进行综合的植物化学、毒理学和生物学评估。
材料与方法
研究使用的植物材料为来自罗马尼亚蒂米什瓦拉有执照草药房的罗伯特老鹳草地上部分。将干燥植物材料精细研磨后，以70%乙醇为溶剂，在50°C下进行超声辅助提取60分钟。提取液经过滤、旋转蒸发浓缩后，于-20°C储存备用。
植物化学分析采用多种已验证的LC-MS/MS方法。总多酚含量（TPC）通过Folin-Ciocâlteu法测定，以没食子酸当量表示；总黄酮含量（TFC）通过氯化铝比色法测定，以槲皮素当量表示。详细植物化学成分通过五个独立的LC-MS/MS方法进行分析，涵盖23种酚酸和类黄酮、8种附加酚酸和儿茶素、原花青素、植物甾醇（如β-谷甾醇）和生育酚。
抗氧化活性评估采用三种互补的比色法：DPPH自由基清除法、ABTS阳离子自由基清除法和FRAP铁离子还原能力法，结果均以Trolox当量表示。
无机元素分析采用微波消解-石墨炉原子吸收光谱法，对提取物中的十种金属元素含量进行定量，以评估其营养价值和安全性。
抗菌活性评估采用纸片扩散法和肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），测试了提取物对五种参考细菌菌株（包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌）的抑制作用，以左氧氟沙星作为阳性对照。
细胞生物学效应评估以A253人涎腺腺癌细胞系为模型。细胞活力通过MTT法测定。细胞形态学通过明场显微镜观察。克隆形成能力通过克隆形成实验评估。细胞内活性氧（ROS）水平使用ROS-Glo™ H2O2检测试剂盒测定。细胞骨架与细胞核形态通过免疫荧光染色（Hoechst 33342染核，Rhodamine-phalloidin染F-肌动蛋白）观察。 Caspase-3/7和Caspase-9的活性使用Caspase-Glo®发光检测试剂盒测定。所有细胞实验数据均使用GraphPad Prism软件进行统计学分析。
结果
植物化学成分
GR乙醇提取物显示出高含量的多酚和类黄酮化合物。TPC为191.737 ± 5.828 mg GAE/g干提取物，TFC为117.487 ± 8.389 mg QE/g干提取物。LC-MS分析表明，提取物富含多酚类化合物，特别是没食子酸和原儿茶酸。检测到的主要类黄酮包括金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和槲皮苷。酚酸中以绿原酸、阿魏酸和对香豆酸为主。原花青素含量极微。植物甾醇以β-谷甾醇最为丰富。生育酚中仅检测到δ-生育酚，含量较低。
抗氧化活性
三种抗氧化测定结果显示，ABTS法的抗氧化能力最高（3.159 mmol TE/g），DPPH法（2.091 mmol TE/g）和FRAP法（2.061 mmol TE/g）的结果相近但略低。
无机元素
在分析的十种金属中，铁（Fe）是提取物中最丰富的元素，浓度为363.65 ± 4.18 μg/g，其次是锌（Zn）、锰（Mn）、镍（Ni）和铬（Cr）。铜（Cu）以及四种具有潜在毒性的重金属砷（As）、钴（Co）、铅（Pb）和镉（Cd）的含量均低于检测限。
抗菌作用
GR提取物对大多数测试的革兰氏阳性菌（变形链球菌、化脓链球菌、金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）显示出与左氧氟沙星相当的抑菌圈，MIC值为25 μg/mL。然而，其对铜绿假单胞菌的抑制作用显著较弱，抑菌圈仅为7 mm，且未测出MIC值。
对A253癌细胞的生物学效应
细胞活力与形态：MTT实验表明，GR提取物以剂量依赖的方式降低A253细胞活力，在200 μg/mL浓度下，细胞活力下降至19.20%（与对照相比）。明场显微镜观察显示，随着提取物浓度增加，细胞逐渐变得细长，出现胞质收缩，在高浓度下可见轻微的细胞碎片。
克隆形成能力：克隆形成实验表明，GR提取物能强烈抑制A253细胞的克隆形成潜力。在20至200 μg/mL浓度下，克隆形成率分别降至对照组的16.85%至9.00%，呈浓度依赖性抑制。
活性氧（ROS）产生：提取物处理72小时后，在100、150和200 μg/mL浓度下，细胞内ROS水平分别升高至对照组的140.33%、161.02%和195.24%，而在较低浓度（20和50 μg/mL）下ROS水平与对照组相当。
细胞核与细胞骨架形态：免疫荧光染色显示，GR提取物处理引起了剂量依赖性的形态学改变。Hoechst染色显示细胞核逐渐浓缩、荧光强度增加、核尺寸减小，提示染色质凝聚。Rhodamine-phalloidin染色显示F-肌动蛋白信号增强，但细胞铺展减少，细胞形态变得更小、更致密。这些变化在最高浓度下最为明显，符合细胞凋亡相关的核损伤和细胞骨架重塑特征。
Caspase-3/7和Caspase-9活性：GR提取物以剂量依赖的方式激活了caspase-3/7和caspase-9。Caspase-3/7活性在150 μg/mL时达到峰值（对照组的323.01%），caspase-9活性也在同一浓度达到峰值（对照组的327.60%）。在200 μg/mL时，两种caspase的活性虽略有下降，但仍远高于对照组水平。
讨论
本研究对GR乙醇提取物进行了综合表征。其高含量的多酚和黄酮类物质与文献报道一致，尽管具体成分和含量因提取方法、溶剂和植物来源地而异。这些成分是其多种生物活性的物质基础。ABTS法显示出最高的抗氧化能力，这可能与不同方法测定抗氧化机制的差异有关。与文献中其他溶剂（如水、甲醇）的GR提取物相比，本研究使用的乙醇提取物展现了可观且可比的抗氧化潜力。
金属元素分析表明，该提取物富含铁、锌、锰等必需微量元素，而砷、镉、铅、钴等有毒重金属未检出，这为其安全性提供了一定支持，也提示其可能具有一定的营养补充价值。植物从土壤中富集金属的特性意味着产地环境对其金属含量有决定性影响。
抗菌实验证实了GR提取物对多种细菌的抑制能力，尤其是对革兰氏阳性菌。其对铜绿假单胞菌效果较弱，这与该菌本身具有较强耐药性的特性相符。其抗菌活性可能与提取物中的水解单宁等酚类物质有关。
本研究最深入的发现在于GR提取物对A253人涎腺腺癌细胞的抗肿瘤机制。提取物不仅以剂量依赖方式抑制细胞增殖和克隆形成，还诱导了明显的细胞形态学改变，包括核浓缩和细胞骨架重组，这些都是细胞凋亡的典型特征。机制探究表明，提取物在较高浓度下能显著提升癌细胞内的ROS水平，诱导氧化应激。同时，它剂量依赖性地激活了关键凋亡执行蛋白caspase-3/7及其上游启动蛋白caspase-9。ROS的过量产生和caspase通路的激活共同构成了GR提取物诱导A253细胞凋亡的重要机制。这与文献中报道的GR主要成分（如没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山柰酚及代表性单宁化合物geraniin等）所具有的促凋亡、促氧化应激和抑制癌细胞生长的作用相符。本研究首次在A253细胞模型中系统揭示了GR乙醇提取物通过ROS-caspase通路发挥抗癌活性的部分分子机制，为其在抗涎腺癌方面的应用提供了新的实验依据。
结论
本研究综合评估了罗伯特老鹳草地上部分70%乙醇提取物的植物化学组成和生物活性。提取物富含多酚和类黄酮，并表现出显著的抗氧化能力（以ABTS法为最高）。金属元素分析显示其含有丰富的必需微量元素，且有毒重金属含量低于检测限。提取物对多种细菌具有中等程度的抑制活性。在A253人涎腺腺癌细胞中，该提取物表现出剂量依赖性的抗增殖作用，能有效抑制克隆形成，并通过诱导ROS产生和激活caspase-3/7与caspase-9途径，触发癌细胞凋亡。这些发现为罗伯特老鹳草作为一种潜在的天然抗癌药物来源提供了科学支持，并阐释了其部分作用机制。
