纳米颗粒介导的I类和II类MHC抗原的双重递送增强了T细胞免疫和抗肿瘤活性

纳米颗粒递送MHC I/II类抗原协同激活CD8+/CD4+ T细胞增强抗肿瘤免疫。通过E2蛋白纳米颗粒平台在黑色素瘤和结肠癌小鼠模型中，共递送两种抗原显著提高Th1细胞应答（IFN-γ升高8倍）和生存率（黑色素瘤40%/结肠癌71% vs对照组0%/13%）。

作者：李恩雅（Enya Li）、布特科维奇（Nina Butkovich）、塔克（Jo A. Tucker）、纳尔逊（Edward L. Nelson）、王祖文（Szu-Wen Wang）

美国加利福尼亚大学欧文分校化学与生物分子工程系，邮编92697

摘要

基于纳米颗粒（NP）的癌症疫苗疗法通常包含肿瘤相关抗原或新抗原，这些抗原主要受主要组织相容性复合体（MHC）I类限制。这种策略能够促使细胞毒性CD8+ T细胞对肿瘤产生反应。辅助性CD4+ T细胞可以支持CD8+ T细胞介导的反应，并通过MHC II类呈递的肽段被激活。然而，利用NP作为载体来传递MHC I类和II类抗原的策略在抗癌免疫方面的效果尚未得到系统研究。在黑色素瘤和结肠癌的小鼠模型中，我们评估了使用不同NP方法传递MHC I类和II类抗原的效果，这些NP的尺寸处于抗原呈递树突状细胞（dendritic cells）的最佳摄取范围内。我们发现，同时将MHC I类和II类肽段传递到双抗原NP上，可以增强细胞毒性T细胞和辅助性T细胞的增殖，相比单独使用MHC I类或II类肽段或混合使用单一抗原NP的情况更为显著。对于这两种肿瘤模型，双抗原NP还引发了更强的抗原特异性Th1反应，包括高达8倍的干扰素（IFN）-γ分泌。值得注意的是，接种双抗原NP的小鼠生存期显著延长：携带黑色素瘤的小鼠存活率为40%，携带结肠癌的小鼠存活率为71%，而仅接种单一抗原NP的混合物的小鼠存活率分别为0%和13%。这突显了抗原传递策略及其在NP上的位置的重要性，同时将MHC I类和II类抗原传递到同一NP上对于抗癌效果至关重要。

引言

免疫疗法（如癌症疫苗）通常旨在调节树突状细胞（DCs）和T细胞之间的相互作用，以促进抗原特异性、抗肿瘤免疫反应[1]、[2]、[3]。树突状细胞具有交叉呈递的独特能力，即能够分别通过主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类向CD8+ T细胞和CD4+ T细胞呈递抗原。纳米材料在设计上具有灵活性，可以调节由此产生的免疫反应[4]。本研究中使用的纳米颗粒（NPs）能够被树突状细胞优先摄取，研究表明，与单独使用肿瘤相关抗原（TAAs）相比，NPs在增强抗肿瘤效果方面具有优势[4]、[5]、[6]。 疫苗策略可能侧重于单独激活CD8+ T细胞或同时激活CD8+ T细胞和CD4+ T细胞[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。然而，MHC I类和II类肽的空间组织方式（即它们是否应共同传递在同一NP上或分别传递在不同的NP上）是基于NP的癌症疫苗设计中的一个重要但尚未被充分研究的参数。在本研究中，我们探讨了使用NP传递MHC I类和II类抗原表位的不同配置策略，目的是提高抗原特异性免疫反应并延长生存期。 树突状细胞是最强大的抗原呈递免疫细胞，被称为专业抗原呈递细胞[12]。它们通过将抗原呈递给适当的MHC分子并提供共刺激信号来激活T细胞[13]。MHC I类分子向细胞毒性T细胞（CD8+ T细胞）呈现兼容的抗原肽段，而MHC II类分子向辅助性T细胞（CD4+ T细胞）呈现肽段[13]。传统的癌症疫苗疗法主要通过呈现MHC I类抗原来激活CD8+ T细胞，从而引发抗原特异性的细胞毒性抗肿瘤反应[6]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。然而，越来越多的证据表明，同时激活细胞毒性和辅助性T细胞反应具有优势[22]、[23]、[24]。激活树突状细胞与这两种T细胞类型的相互作用可以引发多种生物学反应[12]，包括通过CD40-CD40L相互作用促进树突状细胞成熟[25]、增加CD8+ T细胞分泌促炎细胞因子（如白细胞介素（IL）-2和干扰素（IFN）-γ[26]、[27]，以及促进细胞增殖（图1，C）[26]、[27]、[28]，相比仅与CD8+ T细胞的相互作用（图1，A和B）[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。尽管有这些证据支持树突状细胞同时激活两种T细胞亚群的免疫学优势，但基于NP的疫苗传递MHC I类和II类肽的方式可能会影响这种协同反应的强度。 我们假设，在同一NP上同时传递MHC I类和II类抗原的NP癌症疫苗将引发更强的特异性CD8+ T细胞反应和更强的抗肿瘤反应（图1，C），相比单独传递MHC I类抗原（图1，A）或分别传递MHC I类和II类抗原（图1，B）的策略。为了验证这一假设，我们为两种不同的小鼠肿瘤模型合成了单抗原NP（图1，A）、单抗原NP混合物（图1，B）和双抗原NP（图1，C），并在免疫和肿瘤治疗研究中比较了这些NP策略的效果。 我们之前的研究使用了一种蛋白质NP（E2）来同时传递Toll样受体（TLR）激动剂胞嘧啶-磷酸硫代鸟苷（CpG）和MHC I类黑色素瘤肽gp100_25-33（KVPRNQDWL，简称gp100-I）；这种NP被称为（gp100-I）-CpG-E2[6]、[35]。为了展示该策略的有效性并评估其在不同T辅助（Th）极化背景和MHC单倍型下的稳健性，当前研究在两种同基因肿瘤模型（B16/F10黑色素瘤和CT26结肠癌模型）中评估了这些NP设计策略（图1）。B16/F10模型基于Th1偏好的C57BL/6背景，具有MHC I类H2^b和II类I-A^b单倍型，而CT26模型基于Th2偏好的BALB/c背景，具有MHC H2^d和I-A^d单倍型[36]、[37]。我们选择了以下MHC I类和II类抗原进行结合：gp100-I（gp100_25-33，KVPRNQDWL）和gp100-II（gp10045-59_423-431模拟肽和CT-II（CT26-ME1新抗原，LHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQS）用于结肠癌模型[10]、[38]、[39]、[40]、[41]。 我们使用E2蛋白NP平台来共同传递抗原和佐剂，采用先前的结合策略，在树突状细胞摄取NP后释放抗原和佐剂[35]、[42]、[43]。E2 NP由60个相同的丙酮酸脱氢酶亚单位组成，具有多个优点，包括颗粒尺寸（约30纳米），处于树突状细胞最佳摄取范围内；通过基因工程实现特定功能化；以及高稳定性[42]、[44]、[45]、[46]。我们之前的工作表明，通过将疫苗成分结合到E2 NP上来共同传递，而不是单独给予游离抗原和佐剂，可以提高效果，这可能是由于增强了在活化树突状细胞上的抗原展示并减少了脱靶效应[35]、[42]、[43]。 在本研究中，我们利用E2蛋白NP平台来评估将MHC I类和II类抗原传递给树突状细胞以产生强大的抗肿瘤细胞毒性T细胞反应的策略（图1），并得到辅助性T细胞的支持。虽然C57BL/6小鼠天生倾向于Th1反应，但BALB/c小鼠则倾向于Th2反应[47]、[48]、[49]、[50]。B16/F10是一种侵袭性癌症[48]，但在Th2偏好的BALB/c小鼠中测试抗CT26效果也很重要，因为在这些小鼠中产生Th1反应对于肿瘤清除仍然至关重要，尽管可能更难以实现[47]、[48]。人类中也观察到了不同的Th偏好，影响因素包括种族、性别、遗传或心理状态[51]、[52]、[53]。因此，开发能够在Th1和Th2偏好范围内引发强大抗肿瘤反应的治疗平台是非常有价值的，这也是我们在多种小鼠肿瘤模型中评估主要假设（图1）的动力。

材料

所有材料均从Fisher Scientific购买，除非另有说明。肽段从Genemed Synthesis订购，包括SIINFEKL、gp100-I（gp100_25-33，KVPRNQDWL）、C-gp100-I（CKVPRNQDWL）、gp100-II（gp100_45-59，NRQLYPEWTEAQRLD）、C-gp100-II（CNRQLYPEWTEAQRLD）、CT-I（SPSYAYHQF）、C-CT-I（CSPSYAYHQF）、CT-II（LHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQS）、C-CT-II（CLHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQS），以及用于表征结合比例的C末端荧光标记肽段[FITC-C-gp100-I]

合成并表征了用于黑色素瘤和结肠癌模型的显示MHC I类和II类表型的E2蛋白NP

在这些研究中，通过将E2 NP与CpG佐剂和来自B16/F10黑色素瘤或CT26结肠癌模型的MHC I类和II类抗原结合，合成了几种不同的NP。如图2所示，CpG-E2 NP封装了CpG，但未与抗原肽段结合。将抗原连接到这些CpG-E2 NP上，以检测免疫后CD8+和CD4+ T细胞的反应；黑色素瘤抗原包括来自gp100 TAA的MHC I类和II类肽段

MHC II类抗原在NP上的传递增强了抗原特异性的Th1反应

尽管基于NP的癌症疫苗通常仅包含MHC I类抗原[6]、[80]、[81]，但我们的研究表明，在NP上使用MHC II类肽段（gp100-II，CT-II）可以提高抗肿瘤效果。我们观察到接种了gp100-II NP的小鼠的脾细胞表现出抗原特异性增殖（图4C）。在两种肿瘤模型中，脾细胞和淋巴结（LN）细胞的细胞群体分析也表明T细胞被激活（图4D-E、7D和S6）；同时树突状细胞也得到了增强

结论

在这些研究中，我们探讨了设计NP肽疫苗以共同传递或分别传递MHC I类和II类抗原是否能够更有效地治疗癌症。我们使用了黑色素瘤和结肠癌模型来评估这些设计NP的效果，这些模型代表了不同的MHC单倍型和Th偏好，类似于患者群体中的变化。无论肿瘤模型如何，接种双抗原NP都能实现MHC的共传递

CRediT作者贡献声明

Jo Tucker：撰写 – 审稿与编辑、方法学、概念化。Edward Nelson：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念化。Nina Butkovich：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。Enya Li：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。Szu-Wen Wang：撰写 – 审稿与

数据可用性

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利益冲突声明

所有作者均作为发明人列在代表加利福尼亚大学欧文分校提交的相关专利申请中。作者声明没有其他利益冲突。

6. 致谢

本工作得到了国家生物医学成像与生物工程研究所（R01EB027797）和国家癌症研究所（P30CA062203）的支持。本内容仅代表作者的观点，不一定代表NIH的官方立场。流式细胞术和TEM实验在UCI免疫学流式细胞设施（隶属于Chao Family Comprehensive Cancer Center的共享资源）进行，该设施得到了NCI NIH的支持