在养猪业中，有一种被称为“仔猪杀手”的病毒——猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhoea Virus, PEDV）。它感染新生仔猪后，可导致严重的腹泻、脱水，死亡率高达50-90%，给全球养殖业带来沉重的经济损失。与此同时，另一种细菌性病原体——鼠伤寒沙门氏菌（SalmonellaTyphimurium），尤其是耐药菌株，也在猪场中日益猖獗，不仅威胁猪只健康，也构成严重的食品安全隐患。面对这两种病原体的双重夹击，传统的疫苗策略显得力不从心：现有PEDV疫苗在田间保护效果不佳，特别是难以诱导有效的乳源性免疫，而新生仔猪的生存几乎完全依赖从母乳中获得母源抗体。因此，开发一种能同时应对这两种威胁、并能有效激发母体保护性抗体传递给后代的创新疫苗平台，成为一项紧迫的挑战。
近期，一项发表在《Viruses》杂志上的研究带来了令人振奋的突破。该研究团队独辟蹊径，将前沿的病毒载体技术与经典的细菌疫苗递送系统相结合，设计并验证了一种新型的“二合一”疫苗策略。他们利用一种经过多重基因减毒改造的鼠伤寒沙门氏菌作为“特洛伊木马”，在其内部装载了一个基于塞姆利基森林病毒（Semliki Forest Virus, SFV）的自我复制型RNA（复制子）载体。这个载体就像一台高效的“体内蛋白打印机”，进入宿主细胞后能大量生产PEDV的两个关键抗原蛋白：负责病毒附着和入侵的刺突蛋白S1亚基的N端结构域（S1-NTD），以及高度保守、富含抗原表位的核衣壳蛋白（N蛋白）。通过这种巧妙的组合，研究人员旨在同时激发针对PEDV的强大免疫力，并借助沙门氏菌载体本身，赋予对沙门氏菌病的保护。
为了验证这一设想的可行性，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们采用了分子克隆、蛋白质表达与纯化、Western Blot和免疫荧光等技术确认了抗原在细胞中的成功表达。利用小鼠模型，他们通过体内实验评估了疫苗的安全性、在主要器官的定植与清除情况。在免疫学评价方面，研究综合运用了酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗原特异性抗体（IgG、IgG1、IgG2a），血清中和试验评估抗体阻断病毒感染的能力，定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析细胞因子（如IFN-γ和IL-4）的mRNA表达水平，以及流式细胞术（FACS）检测脾脏中CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞亚群的比例变化。此外，还通过攻毒实验评估了疫苗对野生型鼠伤寒沙门氏菌的防护效果，并通过检测哺乳期仔鼠的抗体水平，评估了母源抗体的被动转移（乳源性免疫）。
3.1. 猪流行性腹泻病毒抗原的评估与表征
研究人员通过生物信息学分析，预测了所选PEDV S1-NTD和N蛋白的三维结构及其潜在的T细胞和B细胞抗原表位，为它们能有效激发细胞免疫应答提供了理论依据。
3.2. 表达猪流行性腹泻病毒抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与验证
成功将编码PEDV S1-NTD和N蛋白的基因克隆到SFV复制子载体pJHL204中，并转入减毒沙门氏菌株JOL2500。Western Blot和免疫荧光分析证实，重组菌株感染的细胞能够有效表达大小约28 kDa（S1-NTD）和58 kDa（N）的目标蛋白，并且绿色荧光信号强烈，表明SFV复制子系统驱动了高水平的抗原表达。
3.3. 递送猪流行性腹泻疫苗抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的安全性评估
安全性实验表明，与野生型菌株（JOL401）导致100%死亡和显著体重下降相比，减毒的重组沙门氏菌株（JOL2669，JOL2670）在接种后第14天即从脾脏和肝脏中被完全清除，未引起小鼠死亡或明显的体重下降，组织病理学检查也未发现显著病变，证实了其良好的安全性。
3.4. 疫苗接种诱导的抗猪流行性腹泻病毒特异性体液免疫应答
ELISA检测显示，接种JOL2669（表达S1-NTD）和JOL2670（表达N）的小鼠，其血清中PEDV特异性的总IgG、IgG1（Th2型相关）和IgG2a（Th1型相关）抗体水平均显著高于对照组，表明疫苗诱导了平衡的Th1/Th2混合型免疫反应。更重要的是，血清中和试验证实，疫苗接种小鼠产生了显著升高的中和抗体滴度，证明了所诱导抗体的功能性保护潜力。
3.5. 细胞因子测定
通过qPCR对脾淋巴细胞重新刺激后的细胞因子mRNA水平进行分析，发现接种疫苗的小鼠脾细胞中，代表Th1型免疫的IFN-γ和代表Th2型免疫的IL-4的mRNA表达量均显著上调，进一步印证了疫苗能够同时激活细胞免疫和体液免疫通路。
3.6. 接种重组鼠伤寒沙门氏菌后CD4+和CD8+T细胞的相对比例
流式细胞术分析显示，与对照组相比，接种JOL2669和JOL2670的小鼠脾脏中，CD4+和CD8+T细胞的比例显著增加。这表明疫苗成功激活了细胞介导的免疫反应，这对于清除像PEDV这样的细胞内病原体至关重要。
3.7. 针对沙门氏菌病的保护性免疫应答
除了针对PEDV的免疫，疫苗还诱导了强烈的抗沙门氏菌免疫。接种疫苗的小鼠产生了高水平的沙门氏菌特异性IgG抗体。在随后的致死性野生型鼠伤寒沙门氏菌攻毒实验中，所有未接种疫苗的对照小鼠均在5天内死亡，而接种了JOL2669或JOL2670疫苗的小鼠全部存活，且临床症状轻微，脾脏组织病理损伤也显著减轻，证明了该疫苗平台能有效预防沙门氏菌病。
3.8. 仔鼠通过被动免疫获得抗猪流行性腹泻病毒能力
本研究的最终目标——诱导乳源性免疫，取得了成功。检测发现，接种了疫苗的母鼠所产的仔鼠，其血清中PEDV特异性的IgG抗体和肠道灌洗液中的IgA抗体水平均显著高于对照组仔鼠。更重要的是，这些仔鼠的血清中也检测到了高滴度的PEDV中和抗体。这确凿地证明，通过疫苗接种在母体内产生的保护性抗体，能够有效地通过胎盘或初乳被动转移给后代，为新生动物提供了关键的早期免疫保护。
这项研究得出结论，基于SFV复制子的载体系统能有效驱动PEDV抗原在宿主细胞质内的高水平表达。所使用的减毒沙门氏菌株（Δlon, ΔcpxR, ΔsifA）在保持有限器官定植以提供足够免疫刺激的同时，具有更高的安全性。由该菌株递送的PEDV疫苗构建体（JOL2669和JOL2670）能够在小鼠体内诱导强大的、具有中和活性的体液免疫和显著的细胞免疫应答，呈现出Th1/Th2混合型免疫极化。尤为关键的是，疫苗接种能使母鼠产生PEDV抗原特异性的乳源抗体，并成功传递给仔鼠，实现了对新生个体的被动免疫。此外，该疫苗还能针对鼠伤寒沙门氏菌的致死性攻击提供完全保护。
其重要意义在于，该研究成功构建并验证了一个创新的疫苗平台，它巧妙地将减毒沙门氏菌的递送效率与SFV复制子的高表达优势相结合。这一平台不仅为开发高效、安全的PEDV疫苗提供了新思路，解决了当前疫苗乳源性免疫不足的难题，还通过沙门氏菌载体本身提供了针对沙门氏菌病的交叉保护，实现了一种疫苗应对两种重要猪病原体的“一箭双雕”效果。这为未来开发用于养猪业的联合疫苗，特别是旨在保护最脆弱的新生仔猪的母源免疫疫苗，奠定了坚实的临床前研究基础。未来的研究方向包括在猪模型中进行PEDV攻毒保护效力评价，并优化免疫程序和剂量，以推动其走向实际应用。
