**1. 引言** CRISPR/Cas系统与电化学发光（ECL）的结合已成为构建高性能生物传感平台的一种有前景的策略。CRISPR系统，特别是Cas12a和Cas13a，能够程序化地识别核酸目标并激活转切割活性（Eisenstein, 2022）。ECL提供了低背景和宽动态范围的灵敏信号输出，使得检测性能难以仅通过基于荧光的方法实现。目前的CRISPR基诊断方法主要依赖于荧光报告，虽然简单且灵敏，但在复杂样本中面临挑战。自荧光干扰、光散射以及对精确光学仪器的需求可能限制定量准确性和即时检测的可行性（Masi et al., 2023; Wei, Wang, She, & Fu, 2025）。这些局限性促使人们探索替代的信号转导机制。ECL技术通过在电极表面进行电化学反应产生光，从而避免了光漂白和背景散射等问题。它具有低背景信号、高信噪比以及与微型化仪器的兼容性（Xin, Su, Cui, Wang, & Song, 2025）。这些特性使得ECL特别适合将CRISPR识别事件转化为稳健的分析信号。CRISPR的特异性与ECL的灵敏度的结合吸引了大量研究兴趣，导致了许多研究探索优化策略，包括探针设计、发光剂开发、电极工程和信号放大。这些研究产生了能够检测多种目标的传感器，包括疾病生物标志物、病原体核酸、环境污染物和酶活性。
CRISPR-ECL领域发展迅速，产生了多种优化策略和应用。然而，缺乏一个综合性的综合研究来整合各研究的发现并评估它们的相对优势。个别研究往往专注于传感器开发的特定方面，使得难以评估不同方法的比较效果。此外，将这些传感器从实验室研究转化为实际应用时面临普遍存在的挑战，但这些挑战尚未得到系统性的研究。因此，需要一篇综合性的综述来整合该领域的研究成果，巩固现有知识，识别新兴趋势，并确定研究空白。本文通过广泛检索近年来（2020–2026年）在主要科学数据库（Web of Science、PubMed、Scopus）上发表的文献，总结了CRISPR-ECL生物传感器的研究和开发进展。首先讨论了与生物传感应用相关的Cas12a和Cas13a的操作原理，强调了它们的独特动力学特性和设计考虑因素。然后从三个相互关联的层面探讨和比较了优化方法：核酸探针设计、传感界面工程和级联信号放大。通过跨研究比较，我们评估了不同方法的优点和局限性，并指出了关键的知识空白。随后，我们总结了在主要目标类别中的应用情况，关注了验证状态和实际障碍。最后，我们指出了剩余的挑战，并讨论了向简化、稳健和适用于即时检测平台的未来发展方向。这篇综述旨在为研究人员提供结构化的参考和关键视角，以推动这一快速发展的领域的进一步创新。
**2. CRISPR/Cas系统的机制** CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于古菌中的适应性免疫机制，其核心功能在于识别和降解入侵病毒和其他外来遗传物质（Jiang et al., 2025）。该系统通过将外来核酸片段整合到宿主基因组的CRISPR阵列中，形成可遗传的免疫记忆。当宿主再次遇到同源的外来核酸入侵时，从CRISPR阵列转录的crRNA可以引导Cas效应蛋白精确识别并切割特定目标序列，从而实现入侵遗传元素的特异性清除（Nussenzweig & Marraffini, 2020; Pacesa, Pelea, & Jinek, 2024）。根据Cas蛋白组成、作用机制和CRISPR结构的差异，CRISPR/Cas系统可分为两大类：I类（Type I、III和IV）系统依赖于多个Cas蛋白组装成效应复合体来执行功能，而II类（Type II、V和VI）系统仅需要一个效应蛋白即可完成核酸切割。广泛使用的Cas9（Type II）、Cas12（Type V）和Cas13（Type VI）都属于II类系统（Li et al., 2023; Makarova et al., 2025）。
从实际检测特性的角度来看，Cas12a的整体激活动力学相对较慢，周转数较低，导致信号增加较为缓慢（Nalefski et al., 2021）。通常需要与预扩增结合使用以提高灵敏度。同时，Cas12a对缓冲液pH值和盐浓度等反应条件较为敏感。crRNA设计必须严格满足5′-TTTV PAM要求，间隔长度约为20 nt。种子区域集中在PAM末端附近，要求与目标序列具有高互补性。
Cas13a蛋白属于VI类CRISPR/Cas系统。与Cas12a的主要区别在于其靶向底物是单链RNA（ssRNA），并且不需要PAM序列进行识别。在切割目标ssRNA后，Cas13a同样会激活非特异性转切割活性；然而，这种活性仅作用于ssRNA分子，不作用于ssDNA。在切割目标ssRNA时，它会在目标序列内部产生切割位点，同时激活的转切割活性可以降解系统中存在的其他非特异性ssRNA。这一特性使其特别适用于涉及ssRNA目标的检测场景，如RNA病毒检测和基因表达水平分析（Zilberzwige-Tal et al., 2025）。
在实际检测性能方面，Cas13a具有更快的激活动力学和更高的周转数，能够实现快速且灵敏的信号放大。它对温度和缓冲液盐条件的变化具有更好的兼容性。其crRNA不需要考虑PAM序列，只需与目标RNA互补，间隔长度通常在20到28 nt之间。5′种子区域对错配非常敏感，使其更适合快速、高灵敏度的RNA目标筛选（Villiger et al., 2024）。
利用其对特定核酸序列的高特异性识别能力和转切割活性，CRISPR/Cas系统为生物传感分析提供了强大的分子识别工具（Dai, Wu, Liu, & Gooding, 2020; Li et al., 2025）。同时，ECL技术通过电化学过程激发光信号，将分析物的化学信息转化为可检测的光信号，具有低背景和高灵敏度等显著优势（Lee, Lee, Ji, Lee, & Hong, 2021）。在此基础上，将CRISPR系统的精确分子识别与ECL的灵敏信号输出相结合，实现了新一代生物传感平台的构建，这些平台结合了高特异性和超高灵敏度，从而实现了目标的高效准确检测。
在此基础上，Zhang等人（Zhang et al., 2025）通过修改双链DNA四面体的顶点并连接ssDNA淬灭分子进一步优化了结构（图3B）。这种设计不仅更有效地模拟了溶液中ssDNA的构象，减少了非特异性吸附，还调节了信号分子与电极之间的距离，优化了电子转移效率。 发夹结构提供了不同的信号转导方式。与线性单链相比，它们稳定的二级结构更有利于CRISPR/Cas系统的识别和切割。在Wang等人的工作中（Wang et al., 2021），设计的发夹报告序列在电极表面附近稳定了g-C3N4纳米片，显著增强了ECL信号。在目标miRNA-141存在的情况下，CRISPR/Cas12a的转切割活性通过3D DNA行走机制被激活。发夹的明确茎环区域为Cas12a提供了可访问且有序的切割底物，实现了超灵敏的检测，检测限为0.331 fM（图3C）。与刚性四面体支架相比，发夹探针依赖于动态构象变化，如果设计不当，这些变化可能会受到阻碍。这两种探针结构各有优势：四面体结构减少了空间阻碍并提高了探针的可访问性；发夹结构通过稳定的二级构象提供了更有序的切割底物。未来的发展可能会结合这两种策略，例如将发夹基序整合到四面体支架中，以实现协同效益。
3.2.2. ECL荧光团的优化 荧光团是CRISPR-ECL系统中信号生成的核心组件，将生物识别事件转化为可量化的光学信号。它们的ECL效率、稳定性和界面功能化直接决定了检测灵敏度和信噪比。 在ECL荧光团领域，Ru(bpy)₃²⁺及其衍生物因其高发光效率、良好的水溶性和成熟的共反应物放大机制而成为经典标记物（Han et al., 2023）。然而，在固相修饰过程中，这些小分子容易泄漏和脱附。它们相对较大的分子尺寸和缺乏有效的靶向功能基团导致在电极表面的固定密度低和排列不良，限制了发光强度和传感器的可重复使用性（Kerr, Doeven, & Francis, 2022）。 为了克服这些限制，研究人员开发了新的固定策略。例如，Zhang等人（Zhang et al., 2025）构建了一种金纳米珊瑚结构的电极，显著增加了固定荧光团的活性位点。这种结构不仅提供了较大的表面积，还通过等离子体共振效应增强了界面电子转移，实现了低至1 fM的目标核酸检测限。 除了优化经典荧光团外，开发新型ECL材料也成为重要的研究方向。Liu等人（Liu et al., 2021）提出了L-甲硫氨酸稳定的金纳米簇（Met-AuNCs）作为新的ECL荧光团。这种材料具有与Ru(bpy)₃²⁺相当的高ECL效率和良好的生物相容性。其超小的尺寸（<3纳米）和丰富的表面官能团使得能够在电极表面实现高密度的共价固定，有效避免了泄漏问题（图4A）。李等人（Li, Liu, Liang, Zhuo, & He, 2023）开发了具有高荧光量子产率和优异光稳定性的功能化聚合物点（Pdots），使其适合与生物识别元件结合使用（图4B）。下载：下载高分辨率图像（160KB）下载：下载全尺寸图像。图4. ECL发光体的优化：(A) L-甲硫氨酸稳定的金纳米簇（Met-AuNCs）的示意图（Liu et al., 2021）；(B) Pdots-DNA的示意图（Li et al., 2023）；(C) QDs@NFs复合材料的检测应用和合成示意图（Li, Yang, Yuan, Zhong, & Zhuo, 2022）。（关于该图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）张等人（Zhang, Zhang, et al., 2025）将C3N4量子点与C3N4纳米花复合，构建了一种异质结构的QDs@NFs复合材料。通过利用匹配的能级促进界面电荷分离，这种材料显著增强了ECL发射强度和稳定性。李等人（Li et al., 2022）将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐（PTCDA）封装在共价有机框架（COF）的通道中。高度有序的多孔结构有效抑制了聚集并减少了由π-π堆叠引起的发光淬灭（图4C）。表2中总结的各种发光体显示了CRISPR-ECL传感器设计的明显演变。传统的分子发射体具有成熟的化学性质和高效率，但其实际应用常常受到渗漏问题和空间阻碍的限制。这促使人们对纳米材料（包括金属纳米簇、量子点和聚合物点）产生了更大的兴趣，因为它们提供了更大的表面积和更多的官能团以实现稳定的固定。然而，它们的合成通常更为复杂，批次间的重复性仍然是商业化应用的一个关注点。像COF或MOF封装的发光体这样的复合结构代表了一种新兴趋势，它结合了多孔框架的稳定性和分子发射体的高效率。尽管取得了这些进展，但在标准化条件下直接比较不同发光体仍然很少见，这使得客观评估它们的相对性能变得困难。未来的研究应优先考虑系统地评估发光体的稳定性、成本和可扩展性以及灵敏度，以指导特定实际应用的选择。
3.2.3. 电极材料及其界面的优化 电极材料是CRISPR-ECL系统中的关键组成部分，作为ECL反应的物理界面和电子转移的介质（表S2）。电极材料直接影响ECL的发光效率、信号稳定性和信噪比（Nikolaou, Valenti, & Paolucci, 2021）。同时，电极界面对Cas蛋白的空间限制使得表面修饰对于减轻空间阻碍和保持切割活性至关重要。在当前的生物传感中，玻璃碳电极和金电极因其优异的导电性、成熟的制备协议和易于修饰而占主导地位（Li et al., 2026）。然而，它们有限的比表面积限制了探针的固定能力（Yin et al., 2023）。此外，它们的二维平面结构在固液界面引入了显著的空间阻碍，抑制了Cas蛋白的活性和反应动力学。为了克服这些瓶颈，研究人员探索了电极材料的创新和表面修饰。王等人（Wang et al., 2021）使用纸质材料制造了一种柔性电极。其天然的三维多孔纤维结构提供了高表面积和可控的亲水性/疏水性，使得能够高效装载三维还原氧化石墨烯和金-钯纳米颗粒等纳米材料。这种结构还利用了纸基底的吸液作用，实现了自主且均匀的反应物传输，为开发便携式、一次性的CRISPR-ECL传感器提供了可行的路径。然而，与金属电极相比，纸质电极的导电性较低，且在水溶液中纸张膨胀可能会影响信号稳定性。在基础电极材料优化的基础上，进一步的表面修饰可以增强其物理化学性质和生物相容性。张等人（Zhang et al., 2021）使用二维材料Mxene（Ti3C2Tx）修饰电极表面，利用其高导电性和丰富的表面官能团来增加发光体和生物探针的固定能力。王等人（Wang et al., 2024）开发了一种多孔水凝胶复合材料（Au@PEI-ABEI@Pt），构建了一个三维网络结构，模拟了更接近实际生物反应的固液微环境。这种材料提供了大量的固定位点，而其相互连接的多孔通道促进了反应物的传输并有助于保持酶的活性（图5A）。下载：下载高分辨率图像（440KB）下载：下载全尺寸图像。图5. 电极材料及其界面的优化以及磁性纳米材料的集成。(A) 用水凝胶电极材料（Au@PEI-ABEI@Pt）修饰的工作电极示意图（Wang et al., 2024）；(B) 基于HRP/Au NPs纳米复合探针和CRISPR/Cas12a诱导的生物传感器的miRNA检测示意图（Wang, Zhao, et al., 2025）；(C) 基于CRISPR/Cas13a调控的miR-543 ECL-RET生物传感器的示意图（Li et al., 2025）；(D) 基于MB/mSi/Ru/A的CRISPR-ECL生物传感器的示意图（He et al., 2025）。每种不同的材料都有其优缺点。纳米结构化的金通过高表面积和等离子体增强作用最大化了灵敏度，但增加了成本和制备复杂性。纸质电极注重简单性和一次性使用，使其适用于即时检测应用，尽管在没有额外放大的情况下灵敏度可能会受到影响。水凝胶界面通过创造类似溶液的环境优化了酶的动力学，但需要仔细控制膨胀和长期稳定性。对于即时检测应用，纸质电极提供了一个实用的解决方案，特别是当与放大策略结合使用时。对于超灵敏的实验室检测，由于其高表面积和信号增强能力，纳米结构化的金电极被广泛采用。
3.2.4. 磁性纳米材料的集成优化 在CRISPR-ECL生物传感器中，磁性纳米材料由于其高比表面积和出色的磁分离能力而显示出显著的优势。高比表面积有助于高效富集信号单元，放大检测信号，而磁分离有助于从样品基质中去除干扰成分，显著抑制背景信号（Gao et al., 2025）。王等人（Wang et al., 2025）设计了一种基于磁性珠固定ssDNA-Au NPs/HRP复合探针的检测策略。目标miRNA-21激活CRISPR/Cas12a的切割活性，切割探针并释放HRP。经过磁分离后，收集含有HRP的上清液，并使用双极电极电化学发光系统进行检测，实现了0.48 fM的检测限（图5B）。李等人（Li, Yang, et al., 2025）通过构建基于电化学发光共振能量转移的生物传感器，将信号生成扩展到光学水平。磁性微球作为载体，固定了DNA功能化的金纳米棒复合物作为淬灭材料。目标激活Cas13a后，切割导致金纳米棒从磁性珠表面分离。分离后收集磁性载体并与发光体反应，实现了6.91 fM的检测限（图5C）。在此基础上，何等人（He et al., 2025）开发了一种核壳结构的磁性纳米复合材料（MB/mSi/Ru/A），将ECL发光体Ru(bpy)₃²⁺封装在中孔二氧化硅壳中，并用Cas12a可切割的ssDNA修饰其表面。这种设计将发光体和淬灭机制集成在单个纳米载体上：在没有目标的情况下，ECL信号被淬灭；当Cas12a被激活时，电子转移恢复，导致ECL显著增强（图5D）。磁性纳米材料的设计不断进步。第一代方法仅使用磁性珠作为ssDNA探针的载体，释放后在单独的电极上进行ECL检测。这些设计是模块化和灵活的，但需要多个转移步骤。第二代设计将发光体集成到磁性载体上，实现了磁捕获后的直接检测。这简化了工作流程，但可能在洗涤过程中导致发光体渗漏。第三代策略在同一磁性载体上同时封装了发光体和淬灭剂，创建了无需外加发光体的集成“信号开启”纳米探针。这些实现了最大程度的集成，但需要复杂的合成和精确控制淬灭效率。选择哪种材料取决于具体应用。对于高通量筛选，第三代集成探针提供了简单性和速度。对于需要最小背景的复杂临床样本，由于更有效的基质去除，可能仍首选第一代分离方法。未来的研究方向可能集中在开发具有更高稳定性、更简单合成和多重编码能力的磁性纳米材料，以实现多个目标的同时检测。
3.3.1. 与聚合酶链反应（PCR）的结合 PCR是一种经典的分子生物学技术，利用DNA聚合酶和热循环实现特定核酸片段的指数级放大。通过将PCR与CRISPR/Cas12a驱动的ECL生物传感器结合，张等人（Zhang et al., 2024）建立了一种高灵敏度的河豚鉴定方法。PCR高效放大目标基因片段，随后通过CRISPR/Cas12a进行特异性识别，激活切割并在电极表面切割淬灭探针，触发ECL信号。该策略能够准确区分四种河豚物种，并能在复杂肉样中检测到低至0.1%的掺假水平（图6A）。然而，PCR需要热循环设备，这可能限制了其在需要简单、低成本仪器的即时检测应用中的实用性。
3.3.2. 与催化发夹组装（CHA）的结合 CHA是一种无酶的等温放大技术，基于核酸链置换反应。其核心原理使用特定的“启动链”作为催化剂，驱动两个发夹探针的级联杂交，循环生成双链DNA产物并实现信号放大（Wang, Wang, Willner, & Wang, 2020; L. Zhao, Song, & Xu, 2024）。通过将CHA与CRISPR-Cas12a结合，吴等人（Wu et al., 2024）构建了一种用于检测胰腺癌相关tsRNA的ECL生物传感器。目标tsRNA触发CHA循环放大，生成dsDNA激活剂，激活Cas12a切割，切割标记有淬灭剂的ssDNA探针并恢复ECL信号。该方法在血清样本中实现了3.33 fM的检测限，并具有良好的选择性和重复性（图6B）。CHA的优点是无酶，降低了成本并简化了操作，但其放大效率通常低于基于酶的方法，这可能限制了某些应用的灵敏度。
3.3.3. 与滚环放大（RCA）的结合 RCA是一种等温放大技术，使用噬菌体DNA聚合酶和环状DNA模板。从与模板互补的短引物开始，聚合酶进行连续延伸，生成由重复序列单元组成的极长单链DNA产物（Cao et al., 2025）。这种线性放大的产物为后续信号放大提供了理想的多价模板。景等人（Jing et al., 2024）开发了一种基于适配体识别的ECL传感策略，触发RCA，随后激活CRISPR/Cas12a。全氟辛酸与其适配体结合后释放的单链DNA作为引物，启动RCA，产生含有多个重复序列的长链DNA。这种产物激活CRISPR/Cas12a切割，切割标记有淬灭剂的发夹探针并恢复ECL信号，在水样中实现了1.97 fM的检测限（图6C）。RCA产生的长重复产物能够实现多个信号输出，但反应相对较慢，通常需要2-4小时。
