在微生物世界的“军备竞赛”中，有一类专门以细菌为猎物的病毒——噬菌体（Bacteriophage）。它们不仅是调控自然生态系统和全球碳循环的关键角色，更因其能精准裂解细菌的特性，被视为应对日益严峻的抗生素耐药性危机的潜在“生物导弹”。然而，尽管宏基因组学等技术揭示了海量的噬菌体遗传信息，但绝大多数噬菌体仍处于“未培养”状态。这背后一个主要的瓶颈，是已沿用百年的传统噬菌体研究方法——噬菌斑鉴定法（Plaque Assay）。这种方法依赖噬菌体在覆盖于固体培养基表面的宿主菌“草坪”上形成肉眼可见的透明斑（即噬菌斑）来进行分离和计数。但这种方法存在固有偏见：它强烈倾向于筛选那些能快速复制、扩散并形成清晰噬菌斑的噬菌体。而那些生长缓慢、不形成典型噬菌斑（nonplaquing）或噬菌斑形态不佳的噬菌体，即便存在且可能携带独特的抗菌酶或抗CRISPR蛋白等宝贵基因，也很容易被忽略。此外，传统方法在测定噬菌体效价、评估细菌对噬菌体的抗性频率以及判断噬菌体属于烈性（lytic）还是温和性（temperate，即可整合进宿主基因组形成溶原状态 lysogeny）生活型时，也往往费时费力、通量低且难以自动化。为了打破这些限制，全面解锁噬菌体世界的隐藏多样性，研究人员开发了一种创新的技术平台。
该研究发表在《SCIENCE ADVANCES》杂志上。研究人员利用了液滴微流控（Droplet Microfluidics）技术，具体包括：设计了能够生成水包油微滴的微流控芯片，将宿主细菌和噬菌体共同封装在皮升级（picoliter）的微滴中，实现单噬菌体分辨率的分隔；使用荧光细胞活性染料（SynaptoGreen C4）标记活菌，通过荧光强度变化来指示微滴内细菌的生长抑制情况（即噬菌体活性）；开发了集成的荧光检测与基于介电电泳（Dielectrophoresis）的分选系统，能够高通量地（>100滴/秒）识别并分离出含有活性噬菌体的“命中”微滴；从环境样本（美国德克萨斯州大学城周边污水处理厂废水）中通过聚乙二醇沉淀法浓缩噬菌体，用于后续的分离比较；使用传统噬菌斑鉴定法作为对照，并通过全基因组测序、生物信息学分析（如progressiveMauve比对、Vclust物种聚类）对分离到的噬菌体进行基因型和表型鉴定。
研究结果
1. Identification of bacterial growth inhibition with single-phage resolution（在单噬菌体分辨率下鉴定细菌生长抑制）
研究人员使用模型噬菌体T7感染大肠杆菌（Escherichia coli）以及Meme感染希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）进行验证。他们将不同浓度的噬菌体与宿主细菌、荧光染料混合后封装进微滴。孵育后，通过荧光显微镜观察和高通量激光检测发现，含有活性噬菌体的微滴因细菌生长被抑制而呈现低荧光强度，反之则呈现高荧光强度。在不同噬菌体浓度下，观测到的细菌生长抑制比例与基于泊松分布（Poisson distribution）的理论预期值高度吻合，证明了PRISM平台能够以单噬菌体分辨率定量检测微滴内的细菌生长抑制情况。通过荧光信号的差异，系统能以超过每秒100个微滴的速度进行数字化筛选。
2. PRISM isolation of plaquing and nonplaquing phages（PRISM分离可形成噬菌斑与不可形成噬菌斑的噬菌体）
为了展示PRISM的实用性，研究人员从环境废水中分离能感染鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的噬菌体。他们将浓缩后的环境样本与宿主菌一同封装，确保每个微滴最多只含一个噬菌体颗粒。孵育后，通过分选系统分离出那些细菌生长被抑制（即荧光信号弱）的“命中”微滴，并将其点样在传统的顶层琼脂平板上进行验证。与此同时，他们使用传统噬菌斑鉴定法对同一份浓缩样本进行噬菌体分离作为对照。结果表明，PRISM方法成功分离出15种独特的噬菌体，而传统方法仅分离出6种。更重要的是，PRISM分离到的噬菌体中，有11种是传统方法未发现的，其中包括多株属于“不可形成噬菌斑”表型的噬菌体（如噬菌体PI10）。这些噬菌体在标准顶层琼脂平板上无法形成清晰的单个噬菌斑，仅产生微弱的混浊区，因此被传统方法遗漏。基因组分析显示，这些非噬菌斑形成噬菌体主要属于Chivirus属，与已知的沙门氏菌噬菌体Chi具有高度同源性。
3. Taxonomic diversity recovered by PRISM versus conventional isolation（PRISM与传统方法回收的噬菌体分类学多样性比较）
对分离到的噬菌体进行全基因组测序和平均核苷酸一致性分析发现，PRISM方法总共回收了7个不同的物种级分类群，而传统方法回收了5个。PRISM回收的噬菌体涵盖了Kuttervirus、Chivirus和Nonanavirus等多个属，其中三个与不可形成噬菌斑表型相关的物种级类群仅被PRISM方法发现。通过将代表性基因组与NCBI数据库比对发现，传统方法（以及PRISM方法）都能回收的物种在数据库中匹配到的相似噬菌体数量较多（约110个），而仅被PRISM回收的物种匹配到的数量较少（约一半），这间接支持了传统方法偏向于分离那些易于培养和传播的噬菌体的假设。
4. Plaque-independent phage titering using PRISM（使用PRISM进行不依赖噬菌斑的噬菌体效价测定）
针对一些难以形成清晰噬菌斑的噬菌体-宿主系统，传统效价测定方法（PFU/ml）结果不稳定、变异大。PRISM提供了一种不依赖噬菌斑形成的效价测定方案。其原理是：根据微滴中噬菌体的感染率（即含有活性噬菌体的微滴比例），结合泊松分布公式，可以反推出原始样品中的噬菌体浓度。研究人员用可形成清晰噬菌斑的T7噬菌体验证了该方法的准确性，其测定结果与传统噬菌斑法基本一致。随后，他们将其应用于一种形成噬菌斑能力很差（poor-plaquing）的噬菌体——Rhodococcus phage ReqiDocB7。传统噬菌斑法测得其效价为3.76 × 108 PFU/ml，但变异很大。而PRISM法（无论是基于显微镜成像还是激光检测）给出的效价估计约为1 × 109 PFU/ml，大约是传统方法的两倍，且结果更为一致和稳定，证明了PRISM在定量难以形成噬菌斑的噬菌体方面的优势。
5. PRISM determination of bacterial phage resistance and phage lifestyle（利用PRISM测定细菌的噬菌体抗性频率和噬菌体生活型）
PRISM平台还可用于评估细菌对噬菌体产生抗性的频率，并快速预测噬菌体的生活型（烈性或温和性），这两者是评估噬菌体治疗潜力的关键参数。研究人员将宿主细菌与高感染复数（MOI）的噬菌体共同封装，孵育后筛选那些在高浓度噬菌体存在下仍能旺盛生长（高荧光）的微滴，这些微滴内含有天然抗性突变细菌或已被温和噬菌体溶原化的细菌。通过统计这类微滴的比例，可以计算出抗性/溶原化频率。使用烈性噬菌体T7进行的实验显示，PRISM测得的抗性频率为每4.4 × 105 个细菌细胞中出现一个抗性细胞，与传统平板法测得的结果（每4.2 × 105 个细胞一个）高度吻合。使用温和噬菌体Lambda进行的实验显示，PRISM测得的溶原化频率为每21个细胞中出现一个溶原化细胞，也与传统方法（每23个细胞一个）结果一致。这种在高MOI下存活微滴频率的显著差异，可用于快速区分烈性噬菌体（存活率极低，对应自发突变抗性）和温和噬菌体（存活率较高，对应溶原化）。
结论与意义
本研究成功开发并验证了名为PRISM的创新液滴微流控平台。该平台的核心价值在于其“不依赖平板培养”的特性，为噬菌体研究带来了一场变革。首先，在噬菌体分离方面，PRISM通过将噬菌体-宿主互作隔离在皮升级微滴中，创造了无数个独立的“微富集”环境，能够以单噬菌体分辨率和高通量的方式，从环境样本中同时分离出可形成噬菌斑和不可形成噬菌斑的噬菌体，显著拓宽了可获得的噬菌体多样性，揭示了传统方法无法触及的病毒种群。其次，在噬菌体表征方面，PRISM能够准确测定那些难以形成清晰噬菌斑的噬菌体的效价，结果比传统方法更稳定可靠；同时，它还能高效测定细菌对噬菌体的抗性频率，并快速预测噬菌体的生活型，这些功能对于筛选具有治疗潜力的噬菌体至关重要。与依赖固体培养基的传统方法相比，PRISM将噬菌体分离时间从数天缩短至24小时以内，并大幅减少了人力与材料成本。尽管平台需要微流控设备的初始投入，但其高通量、自动化潜力以及对极端条件微生物（如嗜热菌、厌氧菌）的兼容前景，使其成为一个强大且通用的工具。综上所述，PRISM平台将噬菌体的分离、定量和关键表征功能整合于一个统一的、高效的微流控系统之中，不仅克服了传统噬菌斑鉴定法的固有偏见，更有望加速新型噬菌体的发现、表征及其在治疗、工业等领域的应用进程。
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