通过半理性工程改造β-法尼烯合成酶的杂交体，以提高红曲菌（Serratia marcescens）中的产量

本研究通过半理性DNA打乱和定向点突变技术，构建新型β-法尼烯合成酶，利用耐萜类化合物的大肠杆菌HBQA7为宿主。经结构分析发现活性位点K197S/F315L/E490D突变增强氢键和疏水网络，使摇瓶发酵产量达8.5 g/L，较亲本提升1.5倍；连续发酵中三突变体产量达63.9 g/L。为酶工程和工业化生产奠定基础。

摘要

本研究通过半理性DNA重排和定向突变技术，开发了一种新型的β-法尼烯合成酶，利用耐萜类化合物的菌株 HBQA7作为β-法尼烯生物合成的宿主。首先，从Artemisia annua和Matricaria chamomilla var. recutita中选择了两种野生型酶进行结构域交换，因为它们的β-法尼烯产量较高且序列同源性达到92.33%。具体而言，通过序列保守性分析、分子对接和虚拟饱和突变技术确定了最佳嵌合体CH11中的热点区域。随后，通过丙氨酸扫描确定了六个候选突变位点，并通过定点饱和突变评估了这些突变的效果。将这些有益突变进一步组合，构建了双突变和三突变变体。最优变体CH11（K197S/F315L/E490D）在摇瓶发酵条件下产生了8.5克/升的β-法尼烯，相比亲本酶分别提高了1.50倍和1.66倍。分子动力学模拟表明，催化活性的提高归因于底物结合能力的增强，这得益于氢键的形成以及活性位点内疏水网络的加强。在5升连续发酵实验中，三突变体在96小时时产生的β-法尼烯产量达到了63.9克/升。本研究为β-法尼烯合成酶的结构-功能关系提供了新的见解，并为未来的酶工程和工业规模β-法尼烯生物合成奠定了坚实的基础。

图形摘要