马达加斯加以其卓越的生物多样性和特有性而享誉全球，但对许多类群的采样仍严重不足。研究人员评估了环境DNA（eDNA）宏条形码（Metabarcoding）作为在Makira森林保护区（MFPA）快速、非侵入性调查脊椎动物生物多样性方法的有效性，并将其表现与针对一系列脊椎动物类群的常规调查进行了比较。eDNA采样在17个位点共检测到158个操作分类单元（Operational Taxonomic Units, OTUs），在对鸟类（p= 0.000107）、哺乳动物（p= 0.000718）、两栖动物（p= 0.000725）、爬行动物（p= 0.000877）和辐鳍鱼（p= 0.00788）的检测上均优于常规调查。研究人员进一步通过对物种累积曲线渐近线建模来验证了辐鳍鱼的结果，结果支持上述结论。然而，研究也观察到显著的引物偏好性和扩增不一致性，特别是在两栖动物的检测中。由于参考数据库存在分类学空白、DNA降解影响序列质量或长度以及标记特异性限制等因素的综合影响，相当大比例的OTUs无法解析到物种水平。通过使用eDNA数据的物种累积曲线和MFPA的已编目分类群列表，研究人员证明，普遍采用的仅考虑已解析OTUs（而非所有未解析OTUs）的做法会显著低估生物多样性。本研究强调了eDNA作为热带生物多样性评估工具的前景和当前局限性，特别是在与常规采样技术比较时。与单独使用目视调查相比，结合eDNA和常规调查方法使物种检出率提高了66.4%，突显了二者的互补优势，并强化了在生物多样性丰富、数据匮乏地区采用综合监测策略的价值。
一、 研究背景与目的
马达加斯加是全球公认的生物多样性热点和特有性极高的地区，但其生物多样性在许多类群上仍存在采样不足的问题。Makira森林保护区（MFPA）是该国现存最大的完整热带雨林之一，拥有丰富的脊椎动物多样性。然而，传统的野外调查方法存在诸多挑战：成本高昂、耗时费力、难以检测稀有或隐蔽物种，且对人力物力的要求高，不利于在偏远复杂地区进行大规模、快速的生物多样性评估。
在此背景下，研究人员开展本研究，旨在评估和比较环境DNA（eDNA）宏条形码与常规调查方法在马达加斯加热带雨林中评估多类群脊椎动物生物多样性的有效性。研究的核心问题是：eDNA方法能否更有效地检测脊椎动物多样性？该方法存在哪些局限？其与常规方法如何互补？研究成果旨在为类似高生物多样性、数据匮乏地区的生物多样性监测和保护规划提供科学依据，并探讨eDNA技术的应用潜力与优化方向。本论文发表在《Environmental DNA》期刊上。
二、 关键技术方法
本研究采用对比研究设计，于2023年8月至9月在马达加斯加Makira森林保护区的Sahamatreha森林开展。核心方法涉及以下关键技术环节：
1. eDNA采样与处理 ：在20个河流、溪流和湖泊位点采集水样，遵循标准eDNA采样试剂盒（NatureMetrics）流程。样品在野外过滤并保存，随后运送至实验室。DNA提取使用商业试剂盒（DNeasy Blood and Tissue Kit），并使用抑制剂去除试剂盒（DNeasy PowerClean Pro Cleanup Kit）纯化。
2. 宏条形码测序 ：采用两对特异性引物进行PCR扩增，分别靶向线粒体12S rRNA基因（用于脊椎动物）和16S rRNA基因（专用于哺乳动物）。扩增产物经Illumina MiSeq平台进行双端测序。
3. 生物信息学分析 ：原始序列经质控、去除引物、去噪、去除嵌合体后，通过聚类生成操作分类单元（OTUs）。OTUs通过与NCBI核苷酸数据库进行比对进行初步分类学注释，并结合GBIF（全球生物多样性信息网络）的物种分布数据进行本地相关性校验。低丰度序列（<20 reads）及人类、家养哺乳动物序列被排除。
4. 常规调查 ：与研究区域的eDNA采样同步，由分类学专家独立开展了针对鸟类（点计数、雾网捕捉）、哺乳动物（视觉遭遇调查、相机陷阱、雾网）、辐鳍鱼（电鱼、地笼网、刺网）、两栖和爬行动物（样线调查、陷阱调查、机会性搜索）的标准化调查。
5. 统计分析 ：通过比较eDNA与常规调查在同一区域的物种检出数，评估二者有效性。使用Shannon多样性指数分析α多样性。通过物种累积曲线（SACs）拟合Michaelis-Menten模型，估算渐近物种丰富度（Imax ）和调查效率。使用Wilcoxon符号秩检验分析不同方法在各类群检测上的显著性差异。通过rarefaction（再抽样）和bootstrap（自助法）分析，评估引物偏好性和数据库覆盖率对结果的影响。
三、 研究结果
1. 总体检测与多样性
eDNA宏条形码在17个有效位点共检测到158个独特OTUs。各站点间的Shannon多样性指数（H′）存在显著差异，范围从0.379到2.83，表明即使在同一流域内，不同位点的物种多样性也存在高度异质性。
2. 引物偏好性
通过比较12S脊椎动物通用引物和16S哺乳动物特异性引物的检测效果，发现了显著的类群特异性扩增偏好。具体而言，12S引物检测到更多的哺乳动物和辐鳍鱼OTUs，而16S引物检测到更多的两栖动物OTUs。这表明，引物选择会显著影响特定类群的检出效能，凸显了在eDNA研究中针对目标类群优化引物设计的重要性。
3. 分类学分辨率与数据库限制
相当一部分OTUs（特别是两栖动物）无法被鉴定到物种水平。数据显示，平均有20.5个两栖动物OTUs未能鉴定。这说明当前公共参考数据库（如GenBank）中对马达加斯加地区物种的序列覆盖不足，限制了eDNA方法在精确物种鉴定方面的能力。若在分析中仅使用已鉴定的OTUs，会严重低估真实的生物多样性。
4. eDNA与常规方法比较（核心结论）
Wilcoxon符号秩检验结果表明，eDNA宏条形码在所有分析的脊椎动物类群（鸟类、哺乳动物、两栖动物、爬行动物、辐鳍鱼）的检测上均显著优于常规调查（所有比较p < 0.01）。eDNA对稀有、隐秘或难以捕捉的物种显示出更强的检测能力。将两种方法结合使用，比单独使用常规目视调查的物种总检出率提高了66.4%，证明二者具有强大的互补性。
5. 物种累积曲线分析（以辐鳍鱼和两栖动物为例）
• 辐鳍鱼 ：对辐鳍鱼物种累积曲线的模型拟合显示，eDNA方法估算的渐近物种丰富度（Imax = 23.3）更接近MFPA已知的编目物种数（18种）。而常规方法估算的渐近值仅为9.2。在单位人力时间内的物种检测速率上，eDNA是常规方法的近15倍，显示出更高的调查效率。
• 两栖动物 ：研究发现，若在物种累积曲线分析中包含所有OTUs（包括未鉴定OTUs），估算的渐近丰富度（107.7）远高于MFPA已知的两栖动物编目物种数（68种）。这表明，该地区可能还存在大量未被描述或参考序列缺乏的两栖动物多样性。仅使用已鉴定到物种的OTUs会严重低估多样性。
四、 讨论与结论
1. 讨论要点
本研究在承认eDNA方法优势的同时，也深入探讨了其当前存在的局限和应用挑战：
• eDNA的优势与互补性 ：eDNA在检测隐秘、稀有类群方面优势明显，且具有快速、成本相对较低、可标准化等优点。然而，它无法提供物种行为、种群动态等信息。因此，eDNA与常规方法（如相机陷阱、样线调查）结合是最佳策略，可提供更全面的生物多样性信息，本研究66.4%的额外检出率即是明证。
• 方法与技术限制 ：
• 数据库缺口 ：参考序列数据库不完整是限制eDNA物种鉴定精度的最大瓶颈，尤其是在马达加斯加等高特有性地区。这导致大量OTUs无法被鉴定，可能掩盖了未描述物种或隐存种。
• 引物偏好性 ：不同引物对各类群的扩增效率存在显著差异，这会影响检测结果的全面性和可靠性。在研究中需要谨慎选择或组合使用引物。
• eDNA动态复杂性 ：水环境中eDNA的浓度和分布受水流、降解、抑制剂等多种环境因子影响，具有高度时空异质性。这使得利用eDNA读数精确推断物种丰度或精确定位仍面临挑战。
• 采样策略的局限性 ：基于水样的eDNA采样对高度水生（如鱼类）和半水生（如部分两栖类）类群效果最好，但对陆生、树栖或穴居类群（如许多爬行动物）的检测能力有限。未来需要结合土壤eDNA、空气eDNA、雨水eDNA等多样化采样策略。
• 未来研究方向 ：为提升eDNA在生物多样性评估和保育中的应用价值，未来需：1) 加强地区性参考序列库的建设，特别是对博物馆标本和高特有性地区物种的测序；2) 开发和应用互补的eDNA采样技术（如空气、土壤采样）以覆盖更多生态位的物种；3) 将eDNA技术与社区为基础的监测项目相结合，提升长期监测能力；4) 深入探究eDNA浓度与物种生物量、种群数量之间的定量关系模型。
2. 研究结论
本研究评估了淡水eDNA宏条形码与常规调查方法在马达加斯加Makira森林保护区评估脊椎动物生物多样性的表现。结果表明，eDNA方法在检测鸟类、哺乳动物、两栖动物、爬行动物和辐鳍鱼方面均显著优于常规调查。然而，研究也观察到显著的引物偏好性、扩增不一致性，以及因参考数据库存在分类学空白而导致的高比例未鉴定OTUs。通过物种累积曲线分析，研究人员证明，仅考虑已鉴定到物种的OTUs会严重低估真实的生物多样性。本研究表明，eDNA是一种强大的生物多样性评估工具，尤其适用于检测隐秘和稀有物种，但其有效性受参考数据库完整性、引物选择和采样策略的限制。eDNA与常规调查方法具有高度互补性，结合使用可显著提高物种检出率。在生物多样性丰富但数据匮乏的地区，采用这种综合监测策略对于建立准确的生态基线、指导保护优先级划分和评估保护干预措施至关重要。
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