摘要
陆地上的落叶会向水中释放化学物质，形成一种称为“渗滤液”的溶液，这种溶液可能对淡水生物产生直接或间接的影响。在这项研究中，我们调查了六种植物产生的落叶渗滤液对真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）在体外的直接影响，以及这些渗滤液在体内对蝌蚪感染的影响——具体是在蝌蚪接触Bd之前先让它们生活在这些渗滤液中。在我们的体外实验中，所有六种类型的渗滤液都减少了Bd游动孢子的浓度，而且不同类型的渗滤液对Bd游动孢子浓度的影响各不相同。其中，紫松果菊的渗滤液对Bd的影响最为显著，这表明这种植物可能产生了对Bd具有直接危害的化学物质。渗滤液对Bd的负面影响随着渗滤液浓度的增加而增强。在体内的蝌蚪实验中，渗滤液对蝌蚪的存活率、体型、发育或Bd感染没有可测量的影响。我们的研究结果表明，落叶渗滤液可能对Bd产生直接负面影响，但这些影响可能不会显著改变蝌蚪的感染情况。然而，未来的研究仍然有必要来确定渗滤液对自然种群中水生两栖动物及其病原体的全面影响。这些结果强调了理解陆地输入对淡水系统重要性的必要性。
1 引言
水生环境会受到陆地输入的显著影响（例如，参见Likens和Bormann 1974年；Häder和Barnes 2019年；Sullivan和Manning 2019年的研究）。陆地植物叶片进入淡水环境是常见的输入来源之一（Fisher和Likens 1973年；Drake等人2018年）。植物落叶可以通过增加栖息地的复杂性、作为食物来源以及释放改变水质的化学物质来改变淡水系统（Stoler和Relyea 2020年的综述）。水生系统中落叶的浓度和组成在时间和空间上都有所变化，可能对水生生物产生多种影响。例如，根据植物种类和生态背景，水生系统中的落叶密度可能与浮游动物的数量呈正相关或负相关（Watkins等人2011年；Cottingham和Narayan 2013年；Fey等人2015年）。落叶可以改变水生物种之间的相互作用，包括竞争（DiGiacopo和Hua 2022年）、捕食者-猎物关系（Stoler和Relyea 2013年；Burraco等人2018年）以及宿主-病原体相互作用（DiGiacopo和Hua 2022年）。一些研究发现，入侵物种的落叶对本地水生生物的负面影响比本地植物物种的落叶更大（Maerz等人2005年；Burraco等人2018年；Berta和Mott 2023年）。总之，落叶的类型（即植物种类）和浓度是预测水生系统如何受到影响的重要因素。当落叶与水相互作用并释放出次生化学物质时，这种形成的溶液被称为“渗滤液”（Lush和Hynes 1973年）。由于这些水溶性化学物质在不同植物种类之间存在很大差异，渗滤液的化学组成也会因落叶类型的不同而不同（Stoler和Relyea 2016年；Stoler、Berven和Raffel 2016年）。并非所有渗滤液在水生系统中的效果都相同；它们的化学成分（例如酚酸、溶解碳、营养物质）会影响水生过程，包括生产力、水质透明度、pH值、分解作用、微生物活动以及消费者的发育和死亡率（参见Stoler和Relyea 2020年的例子）。例如，落叶中的营养物质通常与这些系统中的初级生产力变化有关，而酚酸的数量可能更直接地影响水生物种的死亡率（Cohen等人2012年；Stoler、Berven和Raffel 2016年；Stoler和Relyea 2020年）。渗滤液还可能影响水生系统中的传染病（Davidson等人2012年；Stoler、Berven和Raffel 2016年），包括由两栖动物真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis（以下简称“Bd”）引起的壶菌病。这种病原体与全球两栖动物种群数量的严重下降有关（Fisher和Garner 2020年的综述）。在水生系统中，Bd感染的普遍性和强度存在很大差异（例如，参见Siddons等人2020年；Zumbado-Ulate等人2021年），这部分可能归因于落叶输入的变化。Stoler、Berven和Raffel（2016年）的先前研究发现，增加的渗滤液浓度通常会降低体外的Bd密度，但渗滤液的影响因植物种类而异，在含有高浓度酚酸的植物渗滤液中效果最为明显。另一项研究发现，来自桉树（Eucalyptus camaldulensis）叶子的提取物在体外可以降低Bd的密度，而这些植物的叶子存在还可以减少蝾螈的Bd感染（Davidson等人2012年）。因此，渗滤液可以对Bd产生直接负面影响。两栖动物宿主也可能直接受到植物渗滤液的影响（例如，Maerz等人2005年；Watling等人2010年；Earl和Semlitsch 2014年；Burraco等人2018年）。例如，来自入侵物种紫松果菊（Lythrum salicaria）的提取物会增加美洲蟾蜍蝌蚪（Anaxyrus americanus）的死亡率并减缓其发育（Maerz等人2005年）。随着单宁和萜烯浓度的增加，蝌蚪的存活率会下降（Earl等人2012年）。这些对两栖动物的负面影响可能与渗滤液的化学成分有关。例如，来自入侵物种欧亚水蕴草（Myriophyllum spicatum）的次生植物化合物的毒性与北方豹蛙（Lithobates pipiens）体型的减小有关（Curtis和Bidart 2017年）。然而，目前仍缺乏对渗滤液对水生两栖动物宿主和Bd影响的全面了解，特别是这些影响最终如何影响感染结果。在这项研究中，我们旨在（1）量化本地和入侵渗滤液类型（即用于制备渗滤液的植物种类）及其浓度对Bd在体外的直接影响，（2）通过改变感染前的宿主状态来测试渗滤液类型对蝌蚪Bd感染的影响（体内实验）。我们预测（1）渗滤液会在体外直接抑制Bd的生长，（2）预先接触渗滤液会改变蝌蚪对Bd感染的易感性。通过测试来自美国三种本地和三种入侵植物的渗滤液（详见材料与方法部分），我们可以确定植物种类是否会影响渗滤液的效果。
2 材料与方法
2.1 落叶渗滤液和Bd培养物的制备
对于所有实验，我们使用从美国纽约宾汉姆顿大学自然保护区（42.08°N，75.97°W）采集的六种植物的落叶来制备不同类型的渗滤液。这些植物种类包括三种原产于北美的物种（尖叶石南；Spiraea tomentosa、黑越橘；杜鹃花科植物；香蒲；Typhaceae植物）和三种在该地区具有入侵性的物种（紫松果菊；Lythrum salicaria、秋橄榄；Elaeagnus umbellate和普通芦苇；Phragmites australis）。所有这些物种在湿地或其附近都很常见（Blossey等人2001年；Thompson和Jones 2001年；Bellavance和Brisson 2010年；USDA 2022年）。在整个实验过程中，除非另有说明，我们使用的是未经氯处理的井水。每种植物的干燥叶片分别浸泡在浓度为10 g/L的水中40天（用于体外实验）或1 g/L的水中40天（用于体内实验），具体方法参照DiGiacopo等人（2019年）（图S1）。在浸泡过程中，我们每3-4天搅拌并完全淹没叶片，并补充水以弥补蒸发损失。此外，我们还设了一种不含落叶的处理组，处理方法相同。浸泡40天结束后，我们用153 μm的过滤网过滤渗滤液以去除叶片颗粒，然后用紫外光对其进行灭菌。对于所有实验，我们使用了一种从美国俄亥俄州的豹蛙（Lithobates sp.）中分离出的Bd菌株（菌株JSOH1），该菌株在1%的胰蛋白胨液体培养基中维持。为了培养Bd，我们在1%胰蛋白胨琼脂培养皿中加入2 mL的液体培养基，并在21°C下培养7天（用于体外实验）或10天（用于体内实验）。Bd通过有鞭毛的游动孢子阶段传播，然后形成游动孢子囊（游动孢子发育的孢子囊），通过无性繁殖产生更多的游动孢子（Longcore等人1999年）。为了从培养皿中收集Bd，我们用3 mL的高压灭菌去离子水冲洗培养皿15分钟，以便游动孢子释放到水中。然后我们将各培养皿中的溶液合并，并使用血细胞计数器测量游动孢子的浓度。
2.2 体外实验：渗滤液对Bd的直接影响
首先，我们通过在不同的渗滤液类型和浓度下培养病原体来测试渗滤液的直接影响。该实验采用了4 × 6因子设计，包括六种渗滤液类型（如上所述）和每种渗滤液的四种浓度（0.25、0.50、1.00和2.00 g/L）。我们通过用水稀释从10 g/L的起始浓度制备不同的渗滤液浓度。我们还加入了一种无渗滤液的对照组（井水），共计25个处理组，每个处理组重复12次。然后我们在每种渗滤液处理中加入1 g/L的胰蛋白胨粉末以促进Bd生长，并在使用前对溶液进行高压灭菌。实验单元是1.5 mL的微离心管，其中含有900 μL的渗滤液+胰蛋白胨溶液和100 μL的Bd溶液，通过将八个接种了Bd的培养皿中的溶液混合并用水稀释到5 × 10^5游动孢子/mL的浓度来制备。我们在室温（20°C–21°C）和黑暗条件下培养这些溶液（即将其放入密封的保温容器中）。在初次设置后的10天开始，我们使用血细胞计数器测量每个重复样本中总游动孢子（移动和不动的）、移动游动孢子以及游动孢子囊的浓度。我们根据是否存在鞭毛来分类游动孢子，而游动孢子囊则根据是否存在根状结构来识别（Longcore等人1999年）。我们还在没有Bd的对照管中寻找游动孢子和游动孢子囊，没有发现Bd的迹象，从而确认我们的定量方法确实测量到了Bd。由于重复次数较多，我们在4天内分多次测量游动孢子和游动孢子囊，因此该实验的培养期为10–13天，重复样本的测量顺序是随机的。
2.3 两栖动物采集和蝌蚪饲养
我们体内实验的宿主物种是美洲牛蛙（Lithobates catesbeianus），这是一种在美国东部常见的物种，容易受到Bd感染。牛蛙被认为对Bd感染具有相对的耐受性，尤其是在蝌蚪阶段，并且感染强度较高（Garner等人2006年；Schloegel等人2010年；但参见Gervasi等人2013年；Eskew等人2015年）。牛蛙的蝌蚪和大多数两栖动物物种可以在不因Bd感染而死亡的情况下被感染（例如，Searle等人2011年）。我们从位于美国印第安纳州西拉斐特（40.45°N，87.05°W）的普渡野生动物保护区收集了三批牛蛙卵。卵不会被Bd感染，因为它们不含Bd可以感染的暴露角蛋白（Marantelli等人2004年）。我们将每批卵分别饲养在装有水的50加仑室内水箱中，水箱内配备有保持21°C的水族箱空气泵，并通过大窗户创造自然光照周期。孵化后，蝌蚪留在室内水箱中，自由进食鱼片（Tetramin品牌）和苜蓿颗粒，每5天更换一次水。我们使用Gosner阶段25的蝌蚪进行实验；从三个原始卵团中各取等量的蝌蚪，并随机分配到不同的实验处理组中。
2.4 体内实验：感染前蝌蚪接触渗滤液
在体内实验中，我们在蝌蚪接触Bd之前让它们接触渗滤液，以研究渗滤液通过改变宿主状态对感染的影响。我们设置了七种处理组，每种渗滤液处理六次（每种落叶类型一次），浓度为1 g/L，外加一个井水对照组。每个处理组重复18–20次（表S1）。蝌蚪在随机分配的渗滤液处理中浸泡20天（300 mL/处理组），然后放入装有300 mL井水的干净烧杯中，并加入Bd以制备1.3 × 10^4游动孢子的浓度。蝌蚪在含有Bd的烧杯中再停留5天，之后实验结束。我们还进行了另一项活体实验，没有使用井水作为对照组，在实验前后，蝌蚪都暴露于渗滤液之中（见图S2和S3A；表S1和S2）。我们将烧杯随机分配到实验室的4个架子上。每天检查蝌蚪的死亡情况。在实验的最后一天，我们使用过量的MS-222对蝌蚪实施安乐死处理，并将所有蝌蚪保存在≥90%的乙醇中，直到进行感染分析。安乐死处理后，我们按照Gosner（1960）的方法对所有蝌蚪进行了称重和发育阶段的分级。我们使用定量PCR来确定每个存活到实验结束的蝌蚪的Bd感染状态（感染或未感染）以及感染强度（游动孢子的数量）。我们使用无菌解剖剪刀或手术刀移除了每个蝌蚪的口器（例如，三排牙齿和角化的颌部）。然后我们使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit从每个口器中提取DNA。定量PCR采用“快速”方法进行（Boyle等人，2004年；Kerby等人，2013年），所有口器样本都进行了两次重复实验，Bd标准品进行了三次重复实验，浓度范围从100到10^3。如果两个重复实验的孔都显示阳性，则认为该样本是Bd阳性的；如果只有一个孔或没有孔显示阳性，则认为样本是Bd阴性的。这是一种相当保守的感染状态判断方法，可能会导致假阴性结果。我们通过定量PCR输出的两组原始数据的平均值来计算每个Bd阳性个体的感染强度。
2.5 统计分析
所有统计分析都是在R版本4.5.0中进行的（R核心团队，2025年）。对于体外实验，我们构建了一个广义混合效应模型，每个响应变量（总游动孢子、移动游动孢子和孢子囊）都采用了泊松分布（“lme4”包中的“glmer”函数；Bates等人，2015年）。我们选择使用泊松分布是因为这些响应变量是整数。我们的固定效应包括渗滤液类型（即植物种类）、渗滤液浓度以及渗滤液类型和浓度之间的交互作用，以清洁水（浓度为零）作为对照组。我们的随机效应是数据收集的日期。由于渗滤液类型和浓度之间的交互作用不显著，为了简化模型，我们将其从最终模型中移除。对于活体实验，我们将渗滤液类型作为所有模型的预测因子（n=7个水平）。为了比较不同处理下的感染率和感染强度，我们仅使用了整个实验过程中存活下来的蝌蚪的数据，因为早期死亡的动物感染发展的时间较短（见表S1）。为了比较不同渗滤液类型下的感染比例，我们使用了二项广义线性模型。由于参数分析的假设被违反，我们使用了Kruskal-Wallis检验来比较不同渗滤液类型下的感染强度；显著效应通过Dunn检验进行进一步的分析（“FSA”包中的“dunnTest”函数；Ogle等人，2025年），并根据Holm方法调整了p值。我们使用Cox比例风险模型来评估渗滤液类型对蝌蚪存活的影响（“survival”包中的“coxph”函数；Therneau，2024年）。我们使用Kruskal-Wallis检验比较了不同处理下的最终质量，使用泊松广义线性模型比较了发育阶段。在可能的情况下，除了统计测试的结果外，我们还在模型中报告了未经转换的β估计值和效应大小的SE，这些值包括了每种处理的总体效应。
3 结果
3.1 体外实验：渗滤液对Bd的直接影响
增加渗滤液浓度会减少测得的游动孢子总数（X^2(1) = 50.66，p < 0.001，β = −0.235 ± 0.034；图1A）。渗滤液类型也影响游动孢子的总数（X^2(6) = 95.58，p < 0.001）；与对照组相比，在入侵性紫松藻和普通芦苇的渗滤液中生长的蝌蚪的游动孢子数量更多（β = 0.299 ± 0.123，p = 0.015；β = 0.326 ± 0.122，p = 0.008；图1A）。与对照组相比，本地刺柏处理的游动孢子数量也有显著减少（β = −0.251 ± 0.129，p = 0.051），但其他渗滤液处理（黑越橘、香蒲和秋橄榄）与对照组之间没有差异（p > 0.20）。同样，随着渗滤液浓度的增加，移动游动孢子的数量也减少（X^2(1) = 35.61，p < 0.001，β = −0.885 ± 0.167；图1B）。渗滤液类型也影响移动游动孢子的数量（X^2(6) = 64.52，p < 0.001）；四种渗滤液处理减少了移动游动孢子的数量（本地刺柏[β = −1.058 ± 0.342，p = 0.002]和香蒲[β = −0.856 ± 0.328，p = 0.009]、入侵性紫松藻[β = −1.750 ± 0.416，p < 0.001]以及秋橄榄[β = −1.867 ± 0.433，p < 0.001]），两种处理没有显著效果（本地黑越橘和入侵性普通芦苇；图1B）。增加渗滤液浓度还会减少测得的孢子囊数量（X^2(1) = 303.72，p < 0.001，β = −0.761 ± 0.048；图1C）。植物种类也影响孢子囊的数量；与对照组相比，所有渗滤液处理的孢子囊数量都有显著减少（X^2(6) = 161.76，p < 0.001，β估计值范围从−1.01到−0.22；图1C）。渗滤液类型和浓度之间的交互作用对任何响应变量都不是一个显著的预测因子。图1显示了体外实验的结果：渗滤液对Bd的直接影响。结果显示了每个重复样品中（A）总游动孢子（移动和不动的合计）、（B）移动游动孢子或（C）孢子囊的数量。渗滤液类型分别用本地物种SB（刺柏）、BH（黑越橘）和CA（香蒲），以及入侵物种PL（紫松藻）、AO（秋橄榄）和CR（普通芦苇）表示。用星号标出的渗滤液类型与对照组（最左边的处理）有显著差异。每个渗滤液类型的浓度以g L^-1为单位显示在x轴上。箱线图显示了每个处理的中位数（中心线）和四分位数范围（箱体），圆圈表示异常值。有一个非常高的移动游动孢子值（B）没有显示；它出现在香蒲处理中，浓度为0.5 g L^-1，有22个移动游动孢子。
3.2 活体实验：感染前蝌蚪暴露于渗滤液的影响
在所有处理中，活体实验中有73.5%的个体被感染，不同渗滤液类型之间的感染率（X^2(1) = 0.71，p = 0.399；图2A）、感染强度（X^2(6) = 4.87，p = 0.561；图2B）或存活率（X^2(6) = 11.53，p = 0.073；图S3B）没有差异。实验结束时，不同处理之间的体重或发育阶段也没有差异（体重：X^2(7) = 9.39，p = 0.153；阶段：X^2(1) = 0.22，p = 0.931；图S4）。实验结束时的平均蝌蚪体重为0.058（标准差=±0.025），平均发育阶段为25.05（标准差=0.29）。图2显示了感染前蝌蚪暴露于渗滤液的结果。渗滤液类型分别用本地物种SB（刺柏）、BH（黑越橘）和CA（香蒲），以及入侵物种PL（紫松藻）、AO（秋橄榄）和CR（普通芦苇）表示。（A）显示了实验结束时每个渗滤液类型感染个体的比例，以及95%的二项式置信区间。（B）显示了每个渗滤液类型的感染强度，箱线图显示了每个处理的中位数（中心线）和四分位数范围（箱体），以及表示异常值的点。这个实验中不同处理之间的感染率和感染强度没有差异。
4 讨论
落叶从陆地系统进入水体系统可能会对水生生态系统产生重大影响。在本研究中，我们发现渗滤液可以在体外改变Bd的生长（目标1），但这些影响并未在两栖动物宿主在接触渗滤液之前转化为感染率的显著增加（目标2）。渗滤液对Bd的影响因渗滤液类型而异。例如，入侵性紫松藻的渗滤液影响了所有Bd丰度的测量指标，而黑越橘的渗滤液仅改变了孢子囊的数量（图1）。虽然这些差异的机制尚不清楚，但之前的研究表明，渗滤液的化学组成（Stoler, Burke, 和 Relyea 2016；DiGiacopo 等人，2019）以及通过水生微生物群落的间接效应（Christian 等人，2017）可能解释了不同渗滤液类型之间的差异。在我们的研究中，我们对渗滤液进行了杀菌处理，因此我们认为我们的结果主要受水化学成分的影响，而不是不同渗滤液类型下的微生物群落差异。例如，DiGiacopo等人（2019）发现秋橄榄、紫松藻和普通芦苇的渗滤液中含有不同水平的Mn、Ca和K，而沼泽松藻、香蒲和黑越橘的渗滤液中则不含这些元素。在后续研究中，Meindl等人（2020）通过操纵金属浓度来模拟DiGiacopo等人（2019）发现的渗滤液化学组成，并发现化学组成的变化——尤其是Ca的增加——影响了两栖动物的存活率。这强调了化学变化在塑造渗滤液对疾病结果的直接和间接影响方面可能起到的重要作用。此外，没有明确的模式表明入侵物种的渗滤液对Bd的影响大于本地物种的渗滤液（图1和图2），尽管之前的研究预测了这一结果（Maerz等人，2005；Burraco等人，2018；Berta和Mott，2023）。因此，渗滤液的化学组成可能是预测其对淡水生物影响的更好指标，而不是植物种类的来源。体外实验中Bd的不同测量指标对渗滤液的响应不同。我们的模型表明，较高的渗滤液浓度降低了所有三种Bd指标的丰度：总游动孢子数、移动游动孢子数和孢子囊数。这些结果与之前的研究一致，例如Stoler, Berven和Raffel（2016）发现，当统计汇总时，红枫、糖枫、白橡树、杨树、绿梣树和芦苇的叶渗滤液浓度增加会导致游动孢子和孢子囊浓度降低。然而，与之前的研究不同，当评估单个物种的渗滤液影响时，我们发现两种渗滤液处理（入侵性紫松藻和普通芦苇）的总游动孢子数实际上高于对照组，这表明渗滤液可能对游动孢子有积极影响。相反，四种渗滤液处理降低了移动游动孢子的数量，所有六种渗滤液处理都降低了孢子囊的数量。渗滤液对孢子囊的强烈影响可能表明，孢子囊阶段比游动孢子阶段更容易受到渗滤液的影响。总体而言，这些发现表明落叶的变化可以影响病原体的生长，但这些影响并不适用于所有植物物种或入侵环境。这进一步强调了植物特性在预测落叶输入的生态影响方面的重要性（Cohen等人，2012；Stoler, Burke和Relyea，2016）。尽管我们发现渗滤液可以在体外负面影响Bd的丰度，但我们发现渗滤液对蝌蚪的感染几乎没有影响（活体实验）。在我们的两次蝌蚪暴露实验中（即活体实验和补充实验），我们只发现了一种渗滤液对感染的显著影响，即入侵性紫松藻渗滤液处理下的蝌蚪感染强度低于普通芦苇渗滤液处理下的蝌蚪。尽管渗滤液可能对两栖动物宿主有直接的负面影响（Maerz等人，2005；Watling等人，2010；Earl和Semlitsch，2014；Burraco等人，2018），但我们的活体实验中没有观察到渗滤液对存活率、体重、发育阶段或Bd感染的影响。缺乏影响可能是由于我们在实验中使用的浓度；我们选择使用1 g L^-1的浓度来模拟自然系统中常见的浓度（Maerz等人，2005；Stoler和Relyea，2013），但可能需要更高的浓度或更长的暴露时间才能观察到对两栖动物宿体的影响。此外，渗滤液对蝌蚪发育阶段没有影响可能是由于该物种的幼虫期较长（Cook等人，2013）。在野外，渗滤液的间接效应可能通过改变微生物群落和降低溶解氧来实现（例如，Zhao等人，2021）；由于实验中频繁换水，我们预计这些过程对蝌蚪的影响很小。未来的研究需要确定渗滤液可能通过哪些参数影响自然系统中蝌蚪的Bd感染。与其他任何类型的渗滤液相比，入侵性紫松藻的渗滤液对我们的响应变量产生了最多的显著影响。紫松藻渗滤液在体外实验中影响了所有三个Bd丰度指标（图1），并且在补充实验中显示出最低的中位感染率（图S2B）。同样，之前的一项实验室研究评估了秋橄榄、越橘、沼泽苣苔和紫松果菊的渗出液对美洲蟾蜍感染吸虫能力的影响，发现接触紫松果菊渗出液的蝌蚪受到的影响最大，表现为这些蝌蚪的吸虫感染率最高（DiGiacopo和Hua 2022）。因此，与其他类型的渗出液相比，紫松果菊对Bd（蟾蜍布氏囊虫）的负面影响似乎最大。进一步研究紫松果菊在某些情况下减少Bd数量和感染强度的机制，可能有助于识别具有类似影响的其它物种。我们没有发现紫松果菊对两栖动物死亡率和生长有影响（图S3和S4）。紫松果菊渗出液对两栖动物无影响的现象与一些研究结果相反，那些研究表明紫松果菊会对美洲蟾蜍蝌蚪的死亡率增加和生长减缓产生负面影响（Maerz等人2005）。另一项研究发现，接触紫松果菊渗出液的蝌蚪体型和发育速度介于接触其他植物渗出液（沼泽苣苔、秋橄榄、越橘）的蝌蚪之间（DiGiacopo和Hua 2022）。这些矛盾的发现表明，即使在同一植物物种内，渗出液对不同水生生物的影响也会因物种、时间和地点的不同而有所差异，这强调了未来研究植物特性如何影响疾病结果的机制的重要性，而不仅仅是考虑植物本身的身份。我们的结果表明，渗出液可能对水生生物产生直接负面影响，但这些影响并不总是体现在宿主-病原体相互作用的变化上。我们的研究包含了一些在自然系统中不太可能出现的简化假设，例如渗出液浓度始终保持不变，每次只使用一种枯叶层类型（即没有混合渗出液类型的处理），以及忽略了渗出液通过改变微生物群落可能产生的间接效应。此外，在自然系统中，陆地植物、病原体和水生宿主之间的相互作用可能导致对宿主-病原体相互作用的意外影响。例如，之前的一项研究发现，较高的树冠覆盖度与较高的Bd感染率有关，因为树冠的降温效应为病原体创造了有利条件（Becker等人2012）。因此，未来的研究应基于我们的工作，考虑自然系统中枯叶层与水生生物之间的复杂相互作用。然而，我们的发现对于理解枯叶层如何影响水生生物，特别是水生宿主-病原体相互作用具有普遍意义。总体而言，了解渗出液对淡水系统的影响将有助于更好地理解陆地生态系统和水生生态系统之间的联系。
作者贡献：
Emily L. Martin：概念构思（平等）、研究（平等）、方法论（平等）、可视化（平等）、写作——初稿（平等）、写作——审阅和编辑（平等）。
Isabel Adarve-Rengifo：数据管理（平等）、研究（平等）、方法论（平等）、写作——审阅和编辑（平等）。
Spencer R. Siddons：概念构思（平等）、研究（平等）、方法论（平等）。
Paradyse E. Blackwood：研究（平等）、方法论（平等）、写作——审阅和编辑（平等）。
Jessica Hua：方法论（平等）、资源提供（平等）、写作——审阅和编辑（平等）。
Catherine L. Searle：概念构思（平等）、正式分析（平等）、资金获取（平等）、项目管理（平等）、资源提供（平等）、监督（平等）、可视化（平等）、写作——初稿（平等）、写作——审阅和编辑（平等）。
致谢：
我们感谢J. Hua实验室的成员们在枯叶层收集方面提供的帮助，以及J.T. Hoverman实验室在寻找卵块和提供qPCR设备方面给予的支持。该项目得到了Cable-Silkman Fellowship（ELM）、William H. Phillips夏季研究奖学金（ELM）、Purdue-EAFIT合作项目（IAR）、Purdue本科研究办公室（ELM）以及国家科学基金会（CLS: DEB 2044897；JH: DEB 2314625）的支持。我们还感谢CZEUM提供Bd培养物。这项工作是在Purdue动物护理和使用协议1804001734A002的指导下进行的。
资金支持：
本项目得到了生物科学理事会（Directorate for Biological Sciences）的资助，项目编号为DEB 2044897和DEB 2314625。
利益冲突：
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明：
与本手稿相关的数据可在Github（github.com/SearleLabData/Leachate）上公开获取，论文接受后我们也会将其存档在Dryad数据库中（https://doi.org/10.5061/dryad.t4b8gtjhq）。
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