爬行动物尤其是龟类正日益成为比较与进化神经科学的重要模型，但目前仍缺乏标准化的脑灌注与固定方法。研究人员在此首次详细描述了一种分步操作方案，即在断头后通过颈总动脉插管完成龟脑灌注。该方法克服了经心灌注的解剖与技术局限，可将固定液快速、均匀地直接输送至脑血管系统。该方案可稳定获得无血、外观苍白且大体形态保存良好的脑组织。均匀实质固定效果通过高对比度磁共振成像(MRI)、稳定的免疫组织化学标记、无标记受激拉曼组织学(SRH)以及受激发射损耗(STED)显微镜揭示的精细神经元结构得以验证。此外，研究人员还描述了从颅骨中完整分离脑组织的解剖流程。综上，这些方法为均质脑固定提供了稳健框架，可与先进的多尺度成像技术兼容。
该研究由德国萨尔兰大学的研究团队完成，发表于《Methods》。研究背景聚焦于爬行动物特别是淡水龟在神经科学领域的独特价值。龟类具有独特的生理适应性，如对缺氧的极强耐受性，且其背侧脑室脊(DVR)与哺乳动物新皮层存在同源性，是研究神经演化、发育及神经保护的理想模型。然而，现有的龟脑固定主要依赖经心灌注，由于龟类心脏解剖结构特殊（单心室、双主动脉弓），该方法操作繁琐、易产生混淆，且难以保证固定液的均匀输送，导致下游多尺度成像质量受限。为此，研究人员开发了首个针对龟类的颈总动脉插管灌注方案，旨在解决这一技术瓶颈。研究结果表明，该方案能实现固定液的快速、均匀递送，获得的脑组织质量足以支持从宏观磁共振成像到纳米级超分辨显微镜的无缝衔接。这一标准化方法的建立填补了龟类神经科学技术工具的空白，极大地提升了实验的可重复性，为跨物种神经科学研究提供了关键技术支撑。
在开展研究过程中，研究人员主要采用了以下关键技术方法：研究对象主要为红耳滑龟(Trachemys scripta elegans)，并验证了该方法在西部锦龟(Chrysemys picta bellii)和鬃狮蜥(Pogona vitticeps)中的适用性。技术核心在于构建了一套重力驱动灌注系统，并利用断头后的颈部解剖优势进行双侧颈动脉插管。固定后的脑组织通过高分辨率磁共振成像(MRI)评估整体结构，通过无标记受激拉曼组织学(SRH)和免疫荧光染色评估细胞及亚细胞结构，最终利用受激发射损耗(STED)显微镜对树突棘等精细结构进行纳米级解析。
研究结果部分如下：
1. 引言
研究人员指出，传统的“三重脑”理论已逐渐被修正，龟类等爬行动物不再被视为原始谱系，而是理解脊椎动物神经系统保守性与多样性的关键。鉴于现有经心灌注法在龟类应用中存在解剖学挑战和技术缺陷，开发颈动脉灌注方案具有重要的科学必要性。
2. 材料
研究人员详细列出了实施该方案所需的设备、耗材及手术器械清单，包括自制重力灌注系统组件、牙科钻、手术器械及导管等，确保实验的可复制性。
3. 灌注方案
该部分详细阐述了操作流程。3.1 重力驱动灌注系统的构建：系统由4个50 ml注射器储液罐、输液管路及支架组成，通过调节高度控制流速。3.2 灌注准备：分别用磷酸盐缓冲液(PBS)和多聚甲醛(PFA)填充管路并排气。3.3 安乐死与断头：采用腹腔注射戊巴比妥钠(400 mg/kg)进行安乐死，随后使用断头台快速断头。3.4 颈动脉插管与灌注：在解剖显微镜下分离颈总动脉，插入静脉留置针并固定，先以PBS冲洗血液，再以4% PFA进行固定。成功标志为静脉端可见血液流出及头部肌肉僵硬。
4. 脑解剖
研究人员提供了基于颅骨解剖学的详细取材步骤。通过剪除下颌、去除颞肌、摘除眼球、使用牙科钻沿顶骨和枕骨进行皮质骨切开术，最终暴露并完整取出脑组织。强调了不同骨质厚度的差异及避免损伤脑组织的操作要点。
5. 示例结果
结果显示，该方案获得的脑组织呈均匀的苍白色，无明显残留血液。高分辨率MRI显示脑组织对比度高，脑室清晰，各层结构（如视顶盖的板层结构、小脑的颗粒层和分子层）分明。组织学层面，DAPI核染色显示细胞核形态完好，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和连接蛋白43(Cx43)免疫标记证实了蛋白表位的良好保存。无标记SRH成像成功生成了类似H&E的虚拟染色图像，清晰展示了皮质分层。最重要的是，STED显微镜成功解析了稀疏标记的皮层神经元完整的树突树及树突棘的精细形态，包括棘头和棘颈等亚细胞结构。
6. 讨论
研究人员对比了颈动脉灌注与经心灌注的优势。经心灌注需要破坏腹甲，操作复杂且因龟类心脏的特殊解剖结构（单心室、右主动脉弓供应脑部）容易导致插管错误或灌注不均。颈动脉灌注则直接绕过全身循环分流，固定液直达脑部，用量少且效率高。虽然龟类存在颈动脉吻合，单侧插管理论上可行，但双侧插管提供了冗余保障。研究人员强调，这是首个针对淡水龟的详细颈动脉灌注方案，其固定质量足以支持从宏观到纳米级的多种成像技术。此外，该方法稍作修改即可推广应用于其他爬行物种。研究人员总结，该标准化方案将有力推动龟类神经科学的发展，并为理解脊椎动物脑的演化与功能提供坚实的技术基础。
