不同致病型的埃希菌属大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）已知可引起反复发生且广泛流行的犊牛腹泻，并给畜牧业造成显著经济损失。本研究旨在评估腹泻犊牛中E. coli的流行情况，并描述所获得100株分离株的分子特征。研究人员检测了这些分离株的毒力基因，包括papC、eaeA、stI、stII、ltI、stx1、stx2、cnf1和cnf2，以及用于系统发育分类的基因chuA、yjaA、arpA、TspE4.C2 DNA片段、arpAgpE和trpAgpC。此外，还评估了其生物被膜形成能力。研究进一步检测并比较了两种形式氧化锌（zinc oxide，ZnO）——经典无机型与纳米颗粒型——在5种不同浓度下对强生物被膜形成株的作用效果。检测到的毒力基因频率分别为：papC（44%）、stx2（20%）、cnf1（16%）、eaeA（13%）、cnf2（13%）、stx1（4%）和st1（1%）。这些分离株被划分为7个系统发育群，其中最常见的是D群（32%），其次为B1群（25%）、B2群（12%）、C群（10%）、E群（10%）、A群（9%）和F群（2%）。约87%的分离株能够形成生物被膜，其中32%被归类为强生物被膜形成株。两种形式的ZnO在所有测试浓度下均可抑制生物被膜形成，其中纳米颗粒表现出略优的效力。这些结果表明，腹泻犊牛携带多种E. coli致病型，包括产志贺毒素大肠杆菌（STEC）、坏死毒素型大肠杆菌（NTEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）和肠出血性大肠杆菌（EHEC），且其中许多菌株能够形成生物被膜。
该论文发表于《Veterinary and Animal Science》，围绕犊牛腹泻中大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）的分子流行病学特征与生物被膜相关表型展开研究，重点解析不同致病型、毒力基因组成、系统发育群分布及其与生物被膜形成能力之间的关系，并进一步评价氧化锌（zinc oxide，ZnO）及纳米氧化锌（nanoparticle zinc oxide，nZnO）对强生物被膜形成株的抑制作用。研究背景在于，犊牛腹泻是养牛业中最常见且危害显著的疾病之一，既可导致动物健康受损和生产性能下降，也会造成明显经济损失。E. coli作为重要病原之一，既包含大量共栖株，也包含多种可引起肠道或肠外感染的致病株。不同致病型携带不同毒力因子，如志贺毒素（Shiga toxin，Stx）、紧密黏附素intimin、耐热肠毒素及细胞毒性坏死因子等，决定其致病潜能。然而，腹泻犊牛来源E. coli在系统发育群、毒力谱和生物被膜形成方面的综合信息仍不充分，尤其不同分离株在农场环境中借助生物被膜持续存活、耐受清洁消毒、增加传播风险的问题值得重视。因此，开展本研究具有明确的兽医公共卫生和养殖管理意义。
研究人员以斯洛伐克东部8个奶牛场的腹泻犊牛为对象，对分离获得的E. coli进行系统鉴定与分型分析。研究结果表明，腹泻犊牛中E. coli检出率较高，且分离株中同时存在多种致病型，包括STEC、NTEC、EPEC、ETEC、EHEC及若干杂合致病型。不同系统发育群间毒力基因分布不均，其中D群最常见，B1群具有最高的毒力基因组合多样性，而E群中stx2检出尤为集中。绝大多数分离株具有形成生物被膜的能力，且强生物被膜形成在若干重要致病型中占比较高。进一步体外试验显示，经典ZnO和nZnO在全部测试浓度下均能抑制生物被膜形成，且nZnO总体效果略优。上述发现说明，腹泻犊牛不仅是多种潜在高毒力E. coli的宿主，这些菌株还可凭借生物被膜增强环境持留与传播能力，而ZnO尤其是nZnO具有开发为抗生物被膜制剂的潜力。
本研究的主要技术方法包括：自2024—2025年在斯洛伐克东部8个奶牛场采集155份3月龄以下腹泻犊牛直肠拭子样本；经MacConkey琼脂分离培养、ENTEROtest24生化鉴定及基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）确认E. coli；提取细菌DNA后，以多重/单重聚合酶链式反应（PCR）检测系统发育分群基因与9种毒力基因；采用96孔板结晶紫定量法评估生物被膜形成；选取强生物被膜形成株，以5个浓度梯度的ZnO与nZnO进行抗生物被膜试验，并结合双因素方差分析与Fisher确切检验等统计方法评价差异。
3.1. E. coli的分离与系统发育分类
研究人员共检测155份腹泻犊牛样本，经培养、生化及MALDI-TOF MS鉴定后，在100份样本中检出E. coli，检出率为64.5%。随后对100株分离株进行系统发育分类，共归入7个系统发育群。D群为最主要群别，占32%；其次为B1群25%、B2群12%、C群10%、E群10%、A群9%和F群2%。Escherichia cryptic clade I未被检出。该结果说明，腹泻犊牛来源E. coli在群体遗传背景上具有较高异质性，但某些系统发育群，尤其D群与B1群，占据优势地位。
3.2. 毒力决定子的检出情况
在9种目标毒力基因中，实际检出的基因包括papC、stx2、cnf1、eaeA、cnf2、stx1和stI，其中papC检出率最高，为44%；其次为stx2（20%）、cnf1（16%）、eaeA（13%）、cnf2（13%）、stx1（4%）和stI（1%）。32株分离株未检出任何目标毒力基因，39株仅携带1种基因。依据毒力基因组合，研究人员将分离株归类为不同致病型：最常见的是STEC，共17株；其次为NTEC和EPEC，各6株；ETEC与EHEC各1株。研究还识别出杂合致病型，包括STEC/NTEC 5株及EPEC/NTEC 5株。该结果表明，腹泻犊牛体内存在显著复杂的E. coli致病谱，既包含典型肠道致病株，也包含兼具多重毒力特征的复合型菌株。
不同系统发育群中的毒力基因分布存在明显差异。B2群中总体毒力基因分布显著较低。B1群表现出最高的基因组合多样性，25株中有13株至少携带2种毒力基因，说明该群中部分分离株具有较复杂毒力结构。与之相比，A群的毒力基因多样性最低，9株中有6株未检出所测基因。D群虽为最常见群别，但其毒力基因组合相对简单，以papC最常见；B1群相比，D群中cnf1、cnf2和stx2的检出显著更低。E群的特点则是stx2富集明显，10株中6株携带该基因，且该群所有分离株均至少携带1种所测毒力基因。由此可见，不同系统发育背景与毒力谱之间存在结构性差异。
3.3. 生物被膜形成及ZnO物质的抗生物被膜特性
在100株分离株中，87株具有生物被膜形成能力，仅13株不形成生物被膜。按结晶紫法吸光度分级，强、中、弱生物被膜形成株分别占32%、28%和27%。在致病型层面，STEC中14/17为强生物被膜形成株，NTEC为6/6，STEC/NTEC为4/5，ETEC与EHEC各1/1，另有5株仅携带papC基因的菌株也属于强生物被膜形成株。结果表明，重要致病型常伴随较强的生物被膜形成能力，这提示其在宿主肠道及环境中的持续存活潜力较强。尽管不同系统发育群之间难以据此明确划分“更强”或“更弱”的生物被膜表型，但E群全部菌株均能形成至少弱生物被膜，而B1群仅1株不形成生物被膜。
针对32株强生物被膜形成株，研究人员检测了经典ZnO与nZnO在3.12、6.25、12.5、25和50 mmol/L五种浓度下对生物被膜形成的抑制作用。结果显示，两种ZnO形式在所有浓度下均具有抑制效果，且抑制程度随浓度升高而增强。nZnO的平均抑制率为82.04%至91.88%，ZnO为76.02%至88.89%，整体上nZnO略优。统计分析表明，生物被膜形成同时受锌形式和浓度影响，其中浓度效应极显著；在4个浓度水平上，nZnO所致生物被膜形成显著低于ZnO，尤其在较低浓度3.12 mmol/L和6.25 mmol/L时差异更为显著，而在最高浓度50 mmol/L时两者差异无统计学意义。对单株菌统计后发现，全部32株在不同浓度下生物被膜形成均受到显著抑制，但仅17株在锌形式间呈现显著差异。这说明ZnO抑制效应具有普遍性，而nZnO的优势在部分菌株中更为突出。
讨论部分指出，腹泻犊牛中的E. coli感染具有明显复杂性。一方面，部分分离株虽未检出所测毒力基因，但并不意味着完全无致病潜力，尚可能携带未纳入检测范围的毒力因子，或腹泻由其他病原或非感染因素所致。另一方面，系统发育群与腹泻临床表现之间的联系尚未完全明确，但系统发育分型有助于揭示菌株生态适应性和毒力特征。研究中D群最常见，但其毒力基因多样性较低；B1群则更具复杂毒力组合。papC在D、B2和E群中较多见，提示某些肠外致病相关黏附因子也可能参与肠道定植。值得注意的是，研究检出的STEC、NTEC、EPEC、ETEC和EHEC不仅与动物疾病相关，也具有潜在人兽共患风险，尤其是STEC和EHEC与人类严重疾病密切相关。杂合致病型的存在进一步提示犊牛腹泻中E. coli感染谱系并非单一模式，而是多种毒力模块重组并存。
讨论还强调，生物被膜形成是E. coli环境存活和持续传播的重要机制。高比例分离株具有弱至强不等的生物被膜形成能力，说明这些菌株可能在犊牛舍环境中经受清洁、消毒及温度变化后仍然保留活性，从而增加后续动物暴露风险。在此背景下，开发非抗生素型、环境友好型抗生物被膜物质具有现实意义。本研究体外结果显示，ZnO及尤其nZnO对强生物被膜形成株具有稳定抑制作用，支持其作为候选抗生物被膜剂的应用前景。但研究人员也明确指出，本研究仅为体外实验，未涉及活体组织环境中免疫因素、组织结构及其他复杂条件对效应的影响，因此其体内应用价值仍需进一步验证。
结论部分可译为：本研究结果表明，在腹泻犊牛中能够鉴定出E. coli的多种系统发育群和致病型，并可观察到其不同的毒力基因、基因组合以及相对较强的生物被膜形成能力。STEC和NTEC数量较高，同时存在EPEC、ETEC和EHEC，这不仅可能威胁其他农场动物，也可能威胁人类。上述许多分离株可形成生物被膜，这有助于细菌在犊牛转群后仍能在饲养环境中抵抗消毒和清洁而持续存活。基于此，研究人员检测了两种ZnO形式对生物被膜破坏的作用。体外数据表明，两种ZnO在所有测试浓度下均可抑制生物被膜生长，且与ZnO相比，nZnO处理在5个浓度中的4个浓度下导致显著更低的生物被膜形成。经典型和纳米颗粒型ZnO均具有被开发为抗生物被膜制剂的较大潜力。然而，本研究的局限性在于其仅为体外实验，尽管本研究所用商业化nZnO此前已应用于羔羊，并已证实可降低某些细菌群数量。
