GRP75伴侣蛋白驱动的线粒体–内质网膜偶联促进缺氧应激期间Ca2+依赖性ROS积累与铁死亡

铁死亡是近期鉴定出的一种受调控细胞死亡形式，由铁依赖性的脂质过氧化物积累所触发。然而，铁死亡在环境挑战所致氧化应激损伤中的确切功能与机制，尤其是在缺氧应激中的作用，仍不清楚。研究人员在体外和体内大口黑鲈模型中证实，缺氧应激可诱导线粒体相关内质网膜（MAMs）形成异常增加。转录组分析显示，铁死亡通路显著上调。结合转录组学、蛋白质免疫印迹（western blot）和免疫染色结果，研究人员鉴定出GRP75是缺氧条件下MAM形成的关键调控因子。进一步研究表明，沉默GRP75可保护肝细胞免受以铁死亡为标志的缺氧诱导细胞损伤。从机制上看，GRP75导致的MAM过度形成可加速Ca²⁺转运，介导线粒体和内质网功能障碍，并导致ROS积累。基于这些发现，MAMs被认为是铁死亡执行过程中的关键组成部分。

该论文发表于《Journal of Biological Chemistry》，聚焦水生动物在环境缺氧下的肝脏损伤机制，核心问题是阐明缺氧诱导的氧化损伤是否通过铁死亡实现，以及细胞器互作在其中扮演何种调控角色。已有研究表明，铁死亡是一种以Fe²⁺依赖性脂质过氧化为核心特征的调控性细胞死亡，通常伴随谷胱甘肽（GSH）耗竭、膜磷脂过氧化和抗氧化系统失衡。另一方面，缺氧可造成线粒体功能障碍、内质网应激和活性氧（ROS）升高，但这些现象如何通过统一的细胞器通讯机制整合并推动铁死亡，仍缺乏直接证据。研究人员因此以大口黑鲈为研究对象，围绕线粒体相关内质网膜（MAMs）这一内质网与线粒体接触平台，系统探究GRP75介导的膜接触增强是否促进Ca²⁺跨细胞器转运、ROS爆发及铁死亡发生。

研究显示，急性缺氧暴露后，大口黑鲈肝脏出现典型铁死亡相关改变：ROS、脂质过氧化（LPO）、丙二醛（MDA）和Fe²⁺水平升高，总谷胱甘肽下降，铁死亡通路在转录组层面显著富集，且Acsl4、Lpcat3、Por等促铁死亡分子上调。脂质组学进一步发现，肝脏中促铁死亡磷脂底物PE-18:0_20:4与PE-18:0_22:4富集，提示缺氧重塑了易过氧化膜脂环境。与此同时，透射电子显微镜观察到肝脏中线粒体与内质网接触明显增强，MAM长度及线粒体与内质网近距离接触比例增加，说明缺氧不仅诱导氧化损伤，也伴随MAM结构强化。

围绕MAM分子基础，研究人员通过转录组筛查与分子验证确定，GRP75、VDAC1、MCU及DRP1在缺氧肝脏中上调，其中GRP75作为伴侣蛋白连接IP3R1（肌醇1,4,5-三磷酸受体1）和VDAC1（电压依赖性阴离子通道1），构成促进内质网Ca²⁺向线粒体转运的关键复合体。co-IP结果证实，缺氧增强了GRP75与IP3R1、VDAC1之间的相互作用；同时，MCU上调、线粒体Ca²⁺积累增加、ATP下降，伴随P-PERK、GRP78、P-EIF2A、CHOP等内质网应激蛋白，以及DRP1、LC3等线粒体裂变和自噬相关蛋白升高，表明缺氧条件下MAM增强与线粒体功能障碍、内质网应激并行发生。

为验证GRP75的因果作用，研究人员在原代肝细胞中进行GRP75敲低（GRP75-KD），并在ZFL细胞中进行GRP75过表达（GRP75-OE）。结果具有明确方向一致性。GRP75-KD使线粒体与内质网距离增大，MAM长度占线粒体周长比值下降，接触比例降低，且IP3R1、VDAC1、MCU表达减弱，说明GRP75对于维持MAM完整性至关重要。功能上，GRP75沉默减少胞质ROS与线粒体ROS，恢复线粒体膜电位（ΔΨm），降低线粒体Ca²⁺累积，提升ATP和NAD⁺/NADH比值，减轻P-PERK与CHOP升高，降低DRP1与LC3水平，提示其缓解了线粒体损伤和内质网应激。更重要的是，GRP75-KD虽未明显改变细胞内Fe²⁺浓度，却能升高总谷胱甘肽、降低脂质过氧化和MDA，并下调Acsl4、上调Gpx4，表明其通过抑制MAM形成削弱了缺氧诱导的铁死亡过程。

相反，GRP75-OE在ZFL细胞中增强线粒体与内质网共定位，提高Ip3r1、Vdac1、Mcu表达，促进MAM复合体形成并增加线粒体Ca²⁺负荷。其后果包括线粒体膜电位下降、ATP和NAD⁺水平下降、mito-ROS和Cyto-ROS增加、细胞活力下降，并诱导更强的内质网应激与线粒体动力学失衡。与此同时，GRP75-OE增加ACSL4和POR表达，升高LPO与MDA，尽管对Fe²⁺和总谷胱甘肽影响有限，但足以显著加重缺氧背景下的铁死亡表型。由此，研究建立了“GRP75—MAM—Ca²⁺转运—线粒体/内质网功能障碍—ROS积累—脂质过氧化—铁死亡”的机制链条。

主要技术方法方面，研究人员采用大口黑鲈急性缺氧体内模型与原代肝细胞、ZFL细胞缺氧体外模型相结合的策略开展研究；运用RNA-seq与GSEA分析通路变化，采用脂质组学（UPLC/QTOF MS）解析膜脂重塑；通过透射电子显微镜评估MAM超微结构，通过免疫荧光、western blot与co-IP检测GRP75相关复合体形成；结合siRNA敲低与质粒过表达进行功能干预，并测定Fe²⁺、GSH、LPO、MDA、ATP、NAD⁺/NADH、ΔΨm、ROS及线粒体Ca²⁺等指标。体内样本来源为急性缺氧处理后的大口黑鲈肝脏，体外样本为大口黑鲈原代肝细胞和ZFL细胞。

以下结合论文结果部分各小标题进行解读。

2.1. Ferroptosis is present during acute hypoxic stress in the liver
研究人员首先确认急性缺氧过程中肝脏是否发生铁死亡。通过生化指标检测发现，缺氧后肝脏ROS、LPO、MDA及血清和肝脏Fe²⁺显著升高，总谷胱甘肽下降，提示氧化应激和铁负荷增强。转录组GSEA显示铁死亡通路显著上调，Acsl4、Lpcat3等关键正调控因子增加。脂质组学进一步证实促铁死亡磷脂PE-18:0_20:4和PE-18:0_22:4富集，western blot显示ACSL4和POR蛋白升高，说明缺氧为脂质过氧化提供了底物和酶学驱动力。AST和ALT升高则表明肝功能受损。综合而言，研究人员据此认定缺氧肝损伤中存在铁死亡。

2.2. Hypoxic exposure augmented hepatic ER-mitochondria interaction
为寻找缺氧诱导铁死亡的上游机制，研究人员通过透射电子显微镜分析肝脏超微结构。结果显示缺氧显著增强线粒体与内质网的紧密接触，线粒体周长增加，更多线粒体被内质网包裹，MAM长度增加，标准化后的接触比例亦明显升高。该部分结论是：缺氧暴露增强了肝脏ER-线粒体相互作用，提示MAM可能参与铁死亡调控。

2.3. MAM components were highly enriched in hypoxia treated liver, and mitochondrial dysfunction and ERS were induced
在证实MAM结构增强后，研究人员进一步从分子层面分析其机制。RNA-seq提示MAM相关基因中GRP75、VDAC1、MCU和DRP1上调，PACS2下调。RT-qPCR、western blot和免疫荧光证实GRP75及相关复合体分子表达增加，co-IP证明GRP75与VDAC1、IP3R1结合增强。与此同时，MCU升高及线粒体Ca²⁺积累提示Ca²⁺转运活跃；ATP下降和P-PERK、GRP78、P-EIF2A、CHOP、DRP1、LC3升高则说明线粒体功能障碍和内质网应激被诱导。该部分说明：缺氧通过强化IP3R1-GRP75-VDAC1复合体和MAM联系，促进线粒体Ca²⁺超载并诱导细胞器损伤。

2.4. GRP75-KD weakened the degree of MAM coupling
研究人员在原代肝细胞中沉默GRP75，以验证其是否是MAM形成所必需。电镜结果显示，GRP75-KD增加线粒体与内质网距离，降低MAM接触强度；定量分析显示MAM长度比例及接触率均下降。分子层面上，IP3R1、VDAC1、MCU表达下调，co-IP表明复合体相互作用减弱，细胞活性升高。该结果证明：GRP75是维持缺氧条件下MAM结构稳定和细胞低氧耐受的重要支点。

2.5. GRP75-KD inhibited mitochondrial dysfunction and ER stress, and attenuated hypoxia-induced ferroptosis
在GRP75沉默基础上，研究人员评估其对下游损伤事件的影响。结果显示GRP75-KD降低Cyto-ROS和mito-ROS，恢复ΔΨm，减少线粒体Ca²⁺，提高ATP和NAD⁺/NADH比值，减轻P-PERK、CHOP、DRP1和LC3等变化，提示线粒体和内质网功能获得保护。进一步地，尽管Fe²⁺未改变，但总谷胱甘肽增加、脂质过氧化和MDA下降，Acsl4下调而Gpx4上调，说明铁死亡被明显抑制。结论是：阻断GRP75介导的MAM形成可通过缓解细胞器功能障碍和ROS积累而减轻铁死亡。

2.6. GRP75-OE promoted MAM formation and induced mitochondrial Ca²⁺ accumulation, mitochondrial dysfunction, and ER stress
为从反向角度验证GRP75的促进作用，研究人员在ZFL细胞中过表达GRP75。共聚焦成像显示线粒体与内质网共定位升高，MAM相关基因和蛋白表达增加，co-IP证实复合体形成增强，线粒体Ca²⁺进一步积累。与此同时，线粒体自噬、裂变、融合及内质网应激相关基因上调，LC3、DRP1、GRP78、P-EIF-2A和CHOP增加。此部分表明：GRP75过表达足以增强MAM完整性并加剧缺氧导致的Ca²⁺失衡、线粒体损伤和内质网应激。

2.7. GRP75-OE aggravated hypoxia-induced ferroptosis
最后，研究人员直接评价GRP75-OE对铁死亡的影响。结果表明，GRP75-OE增加mito-ROS和Cyto-ROS，降低细胞活力、ΔΨm、ATP和NAD⁺水平，显示线粒体功能进一步受损。在铁死亡终末表型方面，GRP75-OE尽管对Fe²⁺和总谷胱甘肽影响不明显，但显著升高LPO和MDA，并增强ACSL4和POR表达，同时使促铁死亡调控因子上调、Gpx4下调。研究人员据此得出结论：GRP75介导的MAM形成会加重缺氧诱导铁死亡。

讨论部分围绕三个层面展开。首先，论文将MAM引入缺氧铁死亡调控框架，提出MAM不仅是细胞器接触位点，更是促使内质网和线粒体之间死亡信号传播的平台。其次，研究强调线粒体在铁死亡中的积极调节作用：虽然某些经典铁死亡模型可呈现线粒体非依赖性，但在缺氧背景下，线粒体Ca²⁺超载、ROS爆发、ATP耗竭和膜电位丧失显然构成了铁死亡放大的关键环节。再次，论文将GRP75界定为该过程中的关键节点，其通过连接IP3R1与VDAC1增强MAM耦联，促进Ca²⁺由内质网流向线粒体，继而诱发mito-ROS增加和脂质过氧化。作者同时指出，MAM在不同病理环境中的作用可能具有情境依赖性，因此其对线粒体功能和细胞命运的影响仍需结合具体模型判断。研究还明确提出两项局限：一是尚未深入验证MAM介导的跨细胞器脂质转运在缺氧铁死亡中的作用；二是GRP75-MAM-铁死亡轴在体内层面的因果验证仍需进一步加强。

研究结论部分可译为：本研究认为，MAM通过调控Ca²⁺自内质网向线粒体转运并诱导线粒体ROS暴发，从而调节铁死亡。因此，MAM可被用作调控病理或环境应激条件下细胞对铁死亡易感性的潜在靶点。本研究结果还鉴定了鱼类环境抗逆性的关键基因，为环境挑战加剧背景下水产养殖抗逆育种提供了理论指导。