枸杞（Lycium barbarum）是一种重要的传统中药材，广泛分布于中国西北地区。其嫩叶通常被加工成茶或蔬菜。叶片内生真菌（foliar endophytic fungi）对叶片的发育、生长和健康具有响应作用。本研究采用高通量扩增子测序（high-throughput amplicon sequencing）方法，评估了枸杞幼叶、成熟叶和老叶中叶片内生真菌群落的动态变化。结果显示，随着叶片生长进程，叶片内生真菌群落的多样性和均匀度下降，而群落丰富度以及总特异扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs）数量先升高后降低。潜在病原菌链格孢属（Alternaria）是幼叶和成熟叶中的优势属，另一个潜在病原菌节担菌属（Arthrocladiella）是老叶中的优势属。叶片内生真菌的共现网络（co-occurrence networks）初始复杂，但随着叶片生长而简化。功能预测表明，叶片内生真菌群落的潜在植物病原菌功能随叶片生长逐渐增加。除叶片可溶性糖含量外，其他所有因子（包括平均温度、平均湿度、叶片蒸腾速率、叶片净光合速率、叶片铵态氮含量和叶片硝态氮含量）均与枸杞不同叶龄叶片内生真菌群落结构呈显著相关（p < 0.05）。总之，本研究揭示了枸杞不同叶龄叶片内生真菌群落的动态变化和功能，为这些群落的组成、多样性、功能及其与宿主植物的关系提供了新见解。
**研究背景与意义**
枸杞（*Lycium barbarum*）是茄科（Solanaceae）枸杞属的多年生木本植物，其果实富含多糖、黄酮和甜菜碱等活性成分，是重要的传统中药材。枸杞广泛种植于中国西北地区的宁夏、甘肃、青海和新疆，尤其在宁夏有超过600年的栽培历史。研究表明，枸杞叶片与果实的营养成分相似，但叶片中的灰分、粗蛋白、钙、铁、硫胺素和烟酸含量更高，且游离氨基酸含量占叶片总氨基酸的24%，易于人体直接吸收。因此，枸杞嫩叶常被加工成茶或作为季节性蔬菜食用。此外，枸杞还是防风固沙和改良盐碱地的生态树种。叶片是光合作用的重要器官，其表面和内部定殖着丰富的内生真菌（endophytic fungi），它们与宿主植物关系密切，能促进植物生长、防治病虫害、增强胁迫耐受性，并影响宿主植物的生态适应性、进化过程和多样性。然而，关于枸杞叶片不同生长阶段（幼叶、成熟叶、老叶）内生真菌群落的演替模式及其驱动因素，目前尚缺乏系统研究。针对这一科学问题，研究人员利用高通量测序技术分析了枸杞不同叶龄叶片内生真菌群落的多样性、组成、网络结构、功能和组装过程，旨在揭示群落动态及其与叶片生理状态、气候因子和养分因子的关系。该论文发表在《Frontiers in Ecology and Evolution》。
**主要技术方法**
1. **样本采集与预处理**：研究地点位于宁夏回族自治区银川市西夏区芦花台（106°16′39″E，38°64′72″N，海拔1072 m），属温带大陆性气候。选取3个10 m × 10 m的枸杞样地（间距100 m），每个样地内选取5株生长一致的植株，于2024年5月17日（幼叶期）、7月10日（成熟叶期）和10月15日（老叶期）采集健康叶片，每个生长阶段3个重复，共9个样本。叶片经表面消毒（75%乙醇和0.5%次氯酸钠）后，一部分用于DNA提取，另一部分自然干燥后测定养分含量。
2. **高通量扩增子测序与生信分析**：提取叶片总DNA，使用引物ITS1F/ITS2R扩增真菌ITS1区，在Illumina MiSeq PE300平台测序。原始序列经cutadapt去引物、fastp质控、FLASH拼接后，用DADA2去噪获得扩增子序列变体（ASVs），并通过UNITE数据库进行物种注释。生物信息学分析在Majorbio云平台完成。
3. **功能预测与网络分析**：利用FUNGuild工具预测真菌营养类型；基于Spearman相关系数（|r| ≥ 0.5，p < 0.05）构建共现网络。
4. **环境因子测定**：测定平均温度（T）和平均湿度（SD）（田间小型气象站）、叶片蒸腾速率（Z）和净光合速率（JQ）（便携式光合仪LI-6400P）、叶片铵态氮（NH
4 + ，A）、硝态氮（NO
3 − ，X）和可溶性糖（K）含量（可见分光光度法）。通过典范对应分析（Canonical Correlation Analysis, CCA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）评估环境因子对群落结构的影响。
**研究结果**
**3.1 不同叶龄叶片内生真菌群落的多样性**
通过α多样性指数分析，研究人员发现随着叶片生长，Shannon和Simpson指数逐渐下降，在老叶中达到最低值（分别为幼叶最高值的49.27%和62.02%）。丰富度指数（Sobs、Chao、Ace）和均匀度指数Heip先升高后降低，成熟叶丰富度最高，幼叶均匀度最高（为老叶的4.5倍）。基于加权UniFrac距离的主坐标分析（Principal Coordinate Analysis, PCoA）显示，三个叶龄的叶片内生真菌群落显著分离（ANOSIM：R = 0.9095，p = 0.001；PERMANOVA：R
2 = 0.7966，p = 0.008），表明叶龄是驱动群落结构变化的关键因素。
**3.2 不同叶龄叶片内生真菌群落的组成**
在门水平，三个叶龄共发现3个门，子囊菌门（Ascomycota）为优势门（幼叶89.60%、成熟叶75.33%、老叶96.56%），担子菌门（Basidiomycota）相对丰度先升后降（幼叶9.37%、成熟叶24.64%、老叶3.44%）。在科水平，幼叶优势科为norank_o_Pleosporales（34.59%），成熟叶为Pleosporaceae（52.4%），老叶为Erysiphaceae（66.98%）。在属水平，潜在病原菌链格孢属（*Alternaria*）在幼叶（28.59%）和成熟叶（49.94%）中占优势，而另一个潜在病原菌节担菌属（*Arthrocladiella*）在老叶中占优势（66.98%）。线性判别分析效应大小（Linear discriminant analysis Effect Size, LEFSe）分析（LDA值≥3.0）鉴定出：幼叶的生物标志物为Phoma、Cladosporium和unclassified_o_Capnodiales；成熟叶为Sporobolomyces、Pleospora、Epicoccum、Dissoconium、Neocamarosporium、Stemphylium、Phaeosphaeria等；老叶仅Arthrocladiella为生物标志物。在ASV水平，总ASV数和特异ASV数随叶龄先增后减（幼叶69/37个、成熟叶164/91个、老叶76/3个），而两个叶龄间的共有ASV数和比例随叶龄增加。
**3.3 不同叶龄叶片内生真菌群落的共现网络**
基于Spearman相关系数（|r| ≥ 0.5，p < 0.05）构建前200个ASV的相互作用网络。随着叶片生长，节点数、边数、正负边数、平均度（average degree）及负边比例先增后减，成熟叶均最高；正边比例先减后增；网络密度（density）逐渐增加（老叶最高），而模块度（modularity）逐渐降低（老叶最低）。直径、平均路径距离和平均聚类系数在三个叶龄间相似。这表明幼叶网络相对简单，成熟叶网络最复杂（物种间相互作用最强），老叶网络再次简化，但节点间连接更紧密。
**3.4 不同叶龄叶片内生真菌群落的功能**
FUNGuild功能预测显示，幼叶和成熟叶中最丰富的功能是“动物病原菌-内生菌-植物病原菌-木材腐生菌”（Animal Pathogen-Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph），丰度分别为28.59%和49.59%；老叶中最丰富的功能是“植物病原菌”（Plant Pathogen），丰度为66.99%。差异分析表明，植物病原菌功能相对丰度随叶龄显著增加（p < 0.05），提示叶片衰老后植物病原菌风险升高。
**3.5 不同叶龄叶片内生真菌群落的组装过程**
通过βNTI（β-最近分类指数）和RC
Bray （Bray-Curtis随机比）分析，成熟叶的群落组装由漂变（drift）主导（βNTI < 2且RC
Bray < 0.95）；幼叶由漂变和异质选择（heterogeneous selection，βNTI > 2）共同作用；老叶由漂变、异质选择和同质选择（homogeneous selection，βNTI < -2）共同作用。这表明随着叶龄增加，确定性选择在群落组装中的作用增强。
**3.6 驱动不同叶龄叶片内生真菌群落的环境因子**
CCA和PERMANOVA分析表明，除叶片可溶性糖含量（K）外，平均温度（T）、平均湿度（SD）、叶片蒸腾速率（Z）、叶片净光合速率（JQ）、叶片铵态氮（A）和硝态氮（X）均显著影响枸杞不同叶龄叶片内生真菌群落结构（R
2 范围0.626–0.824，p < 0.05）。具体而言，在老叶中，A和X与群落组成呈正相关，但在幼叶和成熟叶中呈负相关；T、JQ和Z在成熟叶和幼叶中呈正相关，在老叶中呈负相关；SD在成熟叶中呈正相关，在幼叶和老叶中呈负相关。
**总结讨论与结论**
本研究表明，枸杞叶片内生真菌群落随叶龄发生显著演替。随着叶片生长，群落多样性和均匀度下降，丰富度先升后降，总ASV数在成熟叶最高，而共现网络先复杂后简化。优势属从幼叶和成熟叶的*Alternaria*转变为老叶的*Arthrocladiella*，且植物病原菌功能比例逐渐增加，提示老叶面临更高的白粉病爆发风险。环境因子（温度、湿度、光合生理指标、氮素形态）而非可溶性糖是驱动群落结构变化的主要因素。研究结论如下：本研究通过扩增子测序调查了枸杞不同叶龄叶片内生真菌群落的多样性和结构。结果显示，幼叶、成熟叶和老叶间叶片内生真菌群落组成差异显著。内生真菌群落的总ASV数和特异ASV数随叶龄先升后降，成熟叶总ASV数最高。群落丰富度的变化与总ASV数一致，但多样性和均匀度随叶龄下降。真菌共现网络初始复杂，随叶龄简化。幼叶和成熟叶的优势菌属为*Alternaria*，老叶为*Arthrocladiella*。植物病原菌预测功能的丰度随叶龄逐渐增加。气候因子、叶片生理状态和微生物利用的养分正向调节叶片内生真菌群落结构。这些发现为枸杞叶片内生真菌群落的组成、多样性和功能及其与宿主植物的关系提供了新见解。
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