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本研究针对内在无序蛋白(IDPs)和内在无序区域(IDRs)难以靶向的难题，开发了基于RFdiffusion的计算设计方法。研究人员通过序列输入扩散和二级结构约束策略，成功设计了针对多种IDPs/IDRs的高亲和力结合剂(Kd低至3nM)，并在细胞水平验证了其功能。该技术突破了传统抗体方法的局限，为糖尿病、神经退行性疾病等与IDPs相关疾病的诊断和治疗提供了新工具。
在生命科学领域，内在无序蛋白(IDPs)和含有内在无序区域(IDRs)的蛋白质约占人类蛋白质组的60%，它们不形成稳定的三维结构却参与众多关键生物学过程。这类蛋白质的构象灵活性使其成为极具挑战性的药物靶点，传统抗体难以有效识别其动态结构。更棘手的是，许多IDPs如胰岛淀粉样多肽(amylin)和朊病毒蛋白(prion protein)的异常聚集与2型糖尿病、阿尔茨海默病等重大疾病密切相关。如何开发能够特异性识别IDPs不同构象状态的高亲和力结合剂，成为困扰学术界多年的难题。
华盛顿大学蛋白质设计研究所(Institute for Protein Design, University of Washington)的Caixuan Liu等研究人员在《Nature》发表突破性研究。他们创新性地将深度学习辅助的蛋白质设计工具RFdiffusion应用于IDPs靶向领域，通过两种策略实现突破：一是仅输入靶标序列的自由构象采样，二是预设β-链等二级结构的约束设计。这种"诱导契合"的设计理念使结合剂能从IDPs的构象库中选择最适配的状态进行结合。
研究采用的主要技术包括：1)基于RFdiffusion的序列输入扩散算法设计结合剂；2)双向部分扩散优化结合亲和力；3)生物层干涉技术(BLI)测定结合常数；4)X射线晶体学验证设计结构；5)细胞共定位实验验证生理条件下的结合；6)硫磺素T(ThT)荧光和负染电镜分析淀粉样纤维抑制效果。研究还使用了来自临床实验室的剩余血浆样本进行质谱检测方法开发。
设计策略与结构验证
研究人员首先以37肽的胰岛淀粉样多肽(amylin)为模型，仅输入序列信息就让RFdiffusion同时采样靶标和结合剂的构象空间。通过双向部分扩散优化，获得四类结合不同amylin构象的高亲和力结合剂(KD 3-100nM)。晶体结构显示，amylin-22aβL结合剂通过螺旋-链混合结构形成结合沟槽，与设计模型高度吻合(Cα RMSD 0.96 Å)。类似方法还成功应用于C肽(CP)、VP48和BRCA1_ARATH等长链IDPs。
靶向短IDRs的β-链结合策略
对于G3BP1、IL-2RG等含有短IDRs的靶标，研究人员开发了二级结构约束的RFdiffusion版本。通过预设靶标区域的β-链构象，设计出的G3BP1-11结合剂(KD 11nM)在晶体结构中展现出精确的β-互补配对。这种策略使设计效率提升50倍，且比传统Rosetta方法获得的结合剂(PRI22，KD 1.88μM)亲和力提高100倍以上。
细胞功能验证
荧光成像证实所有设计结合剂都能在细胞内与全长靶标共定位。特别值得注意的是，G3BP1-11能破坏应激颗粒形成——微流控相图显示其使相分离边界向更高G3BP1浓度移动；细胞实验中，它显著抑制了亚砷酸盐诱导的应激颗粒形成( puncta数从25±3降至8±2)。
治疗应用探索
针对amylin纤维化这一2型糖尿病的病理特征，研究发现设计结合剂能浓度依赖性地抑制纤维形成(1:4摩尔比时完全抑制)，甚至解聚成熟纤维。更引人注目的是，将amylin-36αβ与内吞标签(EndoTag)融合后，可使淀粉样纤维和单体定向运输至溶酶体，流式细胞术检测显示内化效率提高8倍。在诊断方面，amylin-68n结合剂能将质谱检测的回收率提升至62.2%，为临床检测提供了新方案。
这项研究开创了靶向IDPs/IDRs的通用方法学，其意义体现在三个层面：方法论上，证明了RFdiffusion在构象柔性靶标设计中的独特优势；基础研究上，为探索IDPs的构象选择机制提供了新工具；临床应用上，针对糖尿病、神经退行性疾病等开发了潜在的治疗和诊断手段。特别是将计算设计与内吞靶向、质谱检测等技术的创新结合，展现了蛋白质设计在转化医学中的广阔前景。正如作者指出，该方法与新兴的logos技术形成互补，共同构成了靶向蛋白质组"暗物质"的工具箱。
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