染色体外环状DNA通过miRNA表达驱动高级别浆液性卵巢癌进展的机制研究

本研究发现高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）组织中染色体外环状DNA（eccDNA）丰度较正常组织显著提升13倍，并首次揭示其通过微同源介导末端连接（MMEJ）途径生成。研究鉴定出eccDNA携带的致癌性miRNA（eccMIR3661/618/2277）可促进肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭，体内实验证实其显著加速肿瘤生长。该研究为HGSOC的靶向治疗提供了新策略（如靶向LIG3/POLQ），凸显了eccDNA在卵巢癌进展中的关键作用。

eccDNA在HGSOC中的基因组景观

研究团队通过对11例HGSOC组织及5例正常卵巢组织进行Circle-seq分析，共检测到447,562个eccDNA。数据显示HGSOC样本的eccDNA平均数量是正常样本的13倍，体现了HGSOC肿瘤基因组高度不稳定的特征。eccDNA的大小分布范围从100 bp到100 Mb，其中绝大多数集中在100 bp到10 kb之间。与正常组织相比，HGSOC样本中的eccDNA长度更短（中位大小：47,953 bp对156,235 bp），表明HGSOC中DNA碎片化程度更高，可能促进了eccDNA的生物合成。

在基因组区域分布方面，eccDNA在启动子和基因编码区域显著富集。在HGSOC中，eccDNA高度富集于启动子区域（≤3 kb，占35.62%）、内含子区域（29.94%）和外显子区域（8.66%），而在下游区域（≤300 bp，0.13%）和5′UTR区域（0.49%）富集程度较低。正常组织中也观察到类似的分布模式，但总体数量较低。这种分布模式支持eccDNA可能参与HGSOC基因表达调控的潜在功能。

eccDNA生成机制依赖微同源重组

eccDNA的形成与细胞内源性DNA修复机制密切相关。研究团队对eccDNA连接位点两侧20 bp区域的 motif 序列进行了全面分析，发现无论是肿瘤组织还是正常组织，eccDNA连接位点的 motif 序列均表现出对鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）碱基的偏好。尽管正常组和肿瘤组中的同源序列主要集中在小于5 bp的范围内，但癌症组中涉及较长同源序列的微同源重组发生率更高。

eccDNA的大小与连接位点同源序列的长度呈正相关，较短的同源序列对应较小的eccDNA，较长的序列对应较大的eccDNA。这种大小依赖性模式表明eccDNA存在不同的生物合成机制：肿瘤中较小的eccDNA可能通过微同源介导末端连接（MMEJ）产生，而较大的eccDNA可能通过同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）生成。

为了明确DNA双链断裂修复途径（MMEJ、NHEJ和HR）对eccDNA生物合成的贡献，研究团队在SKOV3卵巢癌细胞中系统性敲低了关键通路特异性因子：靶向MMEJ的LIG3和POLQ、靶向NHEJ的KU80和DNA-PKcs、靶向HR的RAD51，以及作为DNA修复上游调控因子的PARP1。PARP1的敲低导致eccDNA丰度显著下降，证明DNA双链断裂修复途径对eccDNA生物合成至关重要。敲低LIG3或POLQ这两个关键MMEJ因子显著减少了eccDNA的产生，并对含有小于10 bp同源序列的eccDNA具有显著影响，进一步支持了MMEJ在eccDNA生物合成中的作用。

相反，敲低NHEJ组件（KU80/DNA-PKcs）显著增加了eccDNA丰度，同时降低了连接处同源序列的整体长度和含有较长同源序列的eccDNA比例。RAD51敲低显示eccDNA积累有适度但不显著的增长趋势，但不影响连接位点的同源序列长度。然而，RAD51的敲低确实减少了含有较长同源序列的eccDNA，支持了先前的研究结果，即HR通过长同源连接产生大的eccDNA。这两种典型修复途径的损伤可能会诱导基因组不稳定性，同时促进对替代机制（如MMEJ）的异常依赖。

HGSOC中差异表达的eccDNA携带基因

为了进一步阐明影响eccDNA在HGSOC组织中结合模式的潜在序列决定因素，研究团队进行了转录因子结合 motif 的富集分析。值得注意的是，在HGSOC组织中鉴定出与致癌基因（如MYB、TGIF2、DLX3、BATF、ZNF165和HOXB4）相关的富集 motif。

在量化eccDNA后，研究团队检测到HGSOC与正常样本之间存在显著差异表达，其中32,847个eccDNA（涉及10,245个基因）显示水平改变。在这些eccDNA中，24,260个eccDNA上调（涉及7,691个基因），8,587个eccDNA下调（涉及3,613个基因）。与之前的研究一致，上调的eccDNA携带致癌基因（如SPOCK2、SLC4A11、KLHL14、KRT19、RHPN2和SLPI），这些基因与HGSOC的不良预后相关。

为了进一步探索促进OC进展的机制，研究团队对HGSOC中上调的eccDNA进行了GO分析，发现上调的eccDNA富集于miRNA相关过程，包括miRNA转录、miRNA转录调控、miRNA代谢调控和RNA代谢的负调控。这些发现表明，由eccDNA编码的上调miRNA可能通过负调控其靶基因促进HGSOC进展。

HGSOC中过表达的eccMIRs产生功能性miRNA分子

大多数eccDNA在癌细胞和正常组织中太小，无法容纳全长的蛋白质编码基因。然而，前体microRNA（pre-miRNA或pre-miR）通常长度在70到90个核苷酸之间，足够紧凑，可以被eccDNA携带。携带pre-miR的eccDNA已被证明可以通过产生可加工成成熟miRNA分子的转录本来抑制内源性靶基因的表达，而不依赖于经典的启动子序列。

基于eccMIR在癌症中的已知调控潜力，研究团队系统性地鉴定了HGSOC中显著上调的eccMIR，并通过反向PCR和Sanger测验证实了三个关键候选者：eccMIR3661、eccMIR618和eccMIR2277。数据库分析（dbDEMC）证实它们相应的成熟miRNA在HGSOC中过表达。通过整合TCGA-OC数据，研究发现这些miRNA位点在部分OC患者中表现出 recurrent 扩增（CN ≥ 3）。通过整合TCGA miRNA-seq数据和拷贝数分析，研究团队观察到所有三种eccMIR均呈现拷贝数依赖性的表达模式。值得注意的是，在拷贝数增加（CN ≥ 3）的样本中，miR-2277的表达显著升高，表现出明显的剂量效应。这些协调的基因组扩增和随之而来的表达增加提供了令人信服的证据，表明eccMIR3661、eccMIR618和eccMIR2277可能在卵巢癌发生中作为致癌驱动因子。

为了功能表征已鉴定的eccMIR，研究团队首先使用连接酶辅助小环积累法（LAMA）合成了三个候选eccMIR（eccMIR3661、eccMIR2277和eccMIR618；700–1,503 bp）以及一个700 bp的随机eccDNA对照（eccRandom）。通过核酸外切酶V抗性限制性内切酶消化测定 rigorously 验证了这些合成构建体的环状性质，确认了其结构完整性以用于后续功能研究。

研究团队首先使用双荧光素酶报告基因测定证实了人工候选eccMIR可以在细胞内成功转录。这涉及将含有与microRNA互补的靶序列的pmirGLO质粒与合成eccMIR共转染SKOV3细胞。在转染后48小时测量信号。结果表明，三种已鉴定的eccMIR显著抑制了含有miRNA靶点3′ UTR序列的相应报告基因，抑制效率在10%到35%之间。此外，研究团队将每种eccMIR和eccRandom转染到SKOV3细胞中，并使用定量PCR（qPCR）评估了相应eccMIR产生的miRNA的相对表达水平。结果表明，这些eccMIR可以高效产生miRNA，其效率超过对照组10倍以上。总之，双荧光素酶报告基因测定和内源性miRNA qPCR测定均证明，通过LAMA合成的eccMIR能够产生功能性miRNA分子。

为了进一步研究eccMIR在HGSOC中的下游通路，研究团队转染了相关的eccMIR，并在SKOV3细胞系中验证了它们的下游靶点。使用miRDB获得了microRNA（MIR3661、MIR618和MIR2277）的预测靶基因集。eccMIR2277的下游靶点通过在转染后48小时进行的qPCR分析得到验证。此外，研究团队进行了转录组测序，以鉴定eccMIR3661和eccMIR618的下游靶点。基于RNA测序结果，研究团队进一步证实合成的eccMIR能够表达相应的miRNA。通过整合从RNA测序数据中鉴定出的下调基因，研究团队成功捕获了eccMIR618和eccMIR3661的差异表达基因和下游靶点。在过表达eccMIR618和eccMIR3661后，上调基因在与肿瘤发生相关的通路中显著富集，例如TGF-β和NF-κB信号通路。该研究阐明了eccMIR通过抑制靶基因来调控基因表达的功能。

候选eccMIRs促进HGSOC细胞生长和转移

尽管先前的研究已经确定eccMIR可以产生功能性miRNA，但它们直接参与肿瘤生长和进展的作用仍未明确。为了解决这个问题，研究团队将三个候选eccMIR（eccMIR3661、eccMIR618和eccMIR2277）转染到HGSOC来源的SKOV3细胞中，并以转染eccRandom的细胞作为对照，系统评估了它们对增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力的影响。

研究团队观察到，过表达eccMIR3661、eccMIR618和eccMIR2277显著促进了SKOV3细胞的增殖。此外，划痕实验和Transwell迁移实验进一步证明，在转染eccMIR3661、eccMIR618和eccMIR2277后，SKOV3细胞的迁移和侵袭能力得到增强。值得注意的是，OVCAR8细胞在eccMIR转染后表现出类似的致癌表型。此外，研究团队进行了功能测定以评估eccMIR3661、eccMIR618和eccMIR2277（eccMix）的组合效应。虽然eccMix显示出比单个eccMIR转染显著更强的促肿瘤效应（增殖/迁移/侵袭），但相对于单个eccMIR的增强并未达到统计学显著性，表明可能存在功能冗余或通路饱和。总的来说，研究团队的发现表明，eccMIR过表达促进了HGSOC细胞在体外的生长、存活和进展。

与体外发现一致，异种移植模型显示，转染eccMIR的SKOV3细胞（eccMIR3661/2277/618）形成的肿瘤明显大于对照组，证实eccMIR驱动的致癌通路在体内仍然具有功能。这有力地证明了肿瘤特异性形成的eccMIR在肿瘤发生和发展中的重要作用。

讨论

本研究为eccDNA在HGSOC中的生物合成机制和功能意义提供了新的见解，特别强调了其通过miRNA调控驱动致癌过程的作用。研究团队的发现揭示，HGSOC中eccDNA的产生与微同源介导的修复通路有关，并且eccDNA来源的miRNA通过调控关键信号网络显著促进肿瘤进展。这些结果拓展了我们对HGSOC分子景观的理解，并突显了eccDNA在癌症生物学中的多面性作用。

eccDNA生物合成的机制见解

HGSOC中eccDNA的形成似乎主要由MMEJ介导，这是一种DNA修复途径，其特点是依赖短同源序列（5-25 bp）来连接DNA双链断裂。这一结果与现有研究一致，研究团队的创新之处在于基于OC细胞系的eccDNA组学图谱（而非局部基因位点）在整体水平上分析了修复通路的调控网络。研究团队观察到HGSOC相关的eccDNA在连接位点具有比正常组织更短的微同源序列，这与晚期肿瘤特有的高度基因组不稳定性和复制应激相一致。对LIG3和POLQ（MMEJ途径中的关键酶）的依赖用于eccDNA生成，强调了易错修复过程在HGSOC中的机制作用。这与先前的研究一致，表明MMEJ有助于癌症中的致癌基因扩增和染色体重排。

有趣的是，敲低NHEJ组件（KU80/DNA-PKcs）和HR组件（RAD51）在eccDNA形成中产生了相反的表型。从机制上讲，NHEJ介导断裂DNA末端的直接连接，不需要同源模板，而HR通过链交换和重组促进基因组稳定性。敲低NHEJ组件（KU80/DNA-PKcs）显著增加了eccDNA丰度，同时降低了整体连接同源长度和含有较长同源序列的eccDNA比例。RAD51敲低显示eccDNA积累有适度但不显著的增长趋势，但不影响连接位点的同源序列长度。然而，RAD51耗竭确实减少了含有较长同源序列的eccDNA，支持了先前证据，即HR通过长同源连接产生大的eccDNA。这两种典型修复途径的损伤可能会诱导基因组不稳定性，同时促进对替代机制（如MMEJ）的异常依赖。

值得注意的是，同源序列长度的尺寸依赖性变异意味着小（<10 kb）与大（>100 kb）eccDNA存在不同的生物合成途径。在HGSOC中富集的较小eccDNA可能通过MMEJ介导的碎片化DNA修复产生，而较大的结构可能源自NHEJ和HR修复途径或染色体碎裂。eccDNA在启动子和编码区域的富集进一步表明，转录活跃位点是DNA双链断裂的热点，使其易于环化。这种空间偏向可能有助于致癌元件的扩增，正如在其他癌症中观察到的那样。

携带miRNA的eccDNA在HGSOC发病机制中的功能作用

研究团队在HGSOC中观察到eccDNA在调控元件中的富集，这与先前关于ecDNA hubs在胶质母细胞瘤中扩增致癌增强子的报道一致。然而，尽管胶质母细胞瘤ecDNA主要携带全基因扩增（例如EGFR），研究团队的数据显示HGSOC eccDNA经常携带碎片化的调控序列（例如启动子来源的eccMIR），表明存在组织特异性的生物合成机制。

本研究开创性地探索了eccDNA作为HGSOC中功能性非编码RNA的载体。eccMIR的鉴定，其携带pre-miRNA（eccMIR3661、eccMIR618和eccMIR2277）以及它们产生成熟miRNA的能力，揭示了一种新的致癌信号机制。这些eccMIR作为移动的转录单元，绕过经典的调控约束，过表达靶向肿瘤抑制通路的miRNA。例如，eccMIR618驱动的TGF-β信号激活可能促进上皮-间质转化（EMT），这是OC转移的一个标志。类似地，eccMIR3661介导的NF-κB信号激活可以增强细胞存活和化疗耐药性，这与该通路在OC中的促肿瘤作用一致。通过体内和体外实验，研究团队证明了eccMIR过表达的功能性后果——增强的增殖、迁移和侵袭——突出了它们对OC侵袭性的贡献。

然而，eccMIR可能发挥放大的致癌效应，因为它们能够独立于染色体约束积累，从而快速适应治疗压力。这种“按需”扩增机制可以解释在OC患者中观察到的药物耐药性的短暂性，其中eccDNA动态可能促进克隆进化。

临床意义和未来方向

eccMIR作为HGSOC中功能性调控因子的发现为治疗干预开辟了新途径。靶向MMEJ通路（例如通过LIG3抑制剂和POLQ抑制剂）可以破坏eccDNA生物合成，可能使肿瘤对化疗敏感。此外，eccMIR来源的miRNA或其下游靶点（例如TGF-β/NF-κB组件）可能作为早期检测或预后分层的生物标志物。eccDNA在调控区域的优先定位进一步表明，eccDNA谱可以反映可用于精准治疗的转录脆弱性。

然而，几个问题仍未解决。首先，尽管研究团队通过严格的纳入标准确保标本质量，但高质量临床标本的稀缺客观上导致样本量不足。其次，eccMIR的起源——它们是产生于复制应激下的特定基因组位点还是随机碎片化——需要进一步研究。第三，eccDNA与肿瘤微环境之间的相互作用，特别是在腹膜转移中，仍未探索。最后，需要跟踪化疗期间eccDNA动态的纵向研究来评估它们在获得性耐药中的作用。

总之，研究团队的工作确立了eccDNA作为HGSOC进展的促进者，通过非编码RNA介导的信号传导发挥作用。通过阐明eccDNA的MMEJ依赖性生物合成及其与miRNA网络的功能性相互作用，本研究为在HGSOC和其他以猖獗基因组不稳定性为特征的恶性肿瘤中开发以eccDNA为中心的治疗策略奠定了基础。