骨骼肌源性细胞外囊泡鞘脂调控：肌肉再生中干细胞命运的新机制与炎症微环境的影响

本研究发现骨骼肌（SkM）细胞释放的大（lEVs）和小（sEVs）细胞外囊泡（EVs）主要通过质膜（PM）出芽形成，其鞘脂组成（尤其是S1P亚型d18:1/d16:1比例）直接调控肌肉干细胞（MuSC）分化与巨噬细胞极化。炎症因子TNF-α通过改变EVs鞘脂谱破坏其促再生功能，提示靶向EVs鞘脂组成可成为增强肌肉再生潜力的新策略。

3.1 鼠源肌管释放两种主要源于质膜的细胞外囊泡亚型

为阐明骨骼肌（SkM）来源细胞外囊泡（EVs）在肌肉稳态调控中的作用，研究首先通过差速离心法分离出大（lEVs）和小（sEVs）两种EVs亚型。动态光散射（DLS）分析显示，10,000 g离心沉淀的lEVs粒径分布较广（50-700 nm；峰值205.15 nm），而100,000 g沉淀的sEVs粒径范围为68-396 nm（峰值159.47 nm）。Western blot和透射电镜（TEM）证实两种EVs均表达经典标志物CD63和CD81，但sEVs特异性富含TSG101和ALIX（ALG-2 interacting protein X）蛋白，与既往人源肌管研究一致。

冷冻电镜（CryoEM）显示lEVs形态异质性高且内含小囊泡，sEVs则呈均匀球形。脂质组学分析表明sEVs和lEVs均富含磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂（SM），但sEVs显著富集磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）及胆固醇，而lEVs脂质谱更接近亲本细胞。小鼠Gastrocnemius肌肉组织来源sEVs同样呈现胆固醇富集特征，提示sEVs生物发生与质膜脂筏微域相关。

扫描电镜（SEM）首次在肌管和肌纤维表面观察到大量纳米囊泡及特殊质膜褶皱结构。免疫金标记显示CD63和CD81定位于这些褶皱区域，TEM进一步证实CD63阳性EVs直接从质膜出芽，且该过程在小鼠和人源肌管中保守存在。腺病毒介导的pHluorin/mScarlet-CD63报告系统实时捕捉到肌管质膜爆发性荧光释放事件，ExoView技术证实标记CD81阳性EVs携带CD63-pHluorin，直接证明EVs从肌管表面释放。虽然研究中观察到多囊体（MVBs）沿微管网络运输，但未发现其与质膜融合现象，表明SkM-EVs主要经由质膜途径生成。

3.2 TNF-α调控肌肉EVs脂质组成与释放

骨骼肌再生过程中，炎症因子TNF-α是关键调节因子。转录组分析显示TNF-α处理的人源肌管中，鞘脂/磷脂代谢通路基因显著改变，包括上调SM水解酶SMPD2和鞘氨醇激酶SPHK1，下调CERK。脂质组学证实TNF-α处理后，肌管和EVs脂质谱发生重塑：sEVs与细胞脂质组成相似度提高，lEVs中溶血磷脂酰胆碱（LPC）比例显著增加，而sEVs和细胞中神经酰胺比例降低。TNF-α还诱导肌管胆固醇蓄积（与HMGCR表达上调一致），并特异性富集于sEVs而非lEVs。

TNF-α处理促进sEVs释放，与肌管表面质膜褶皱数量增加、sEVs标志物TSG101/ALIX富集度升高相关，进一步印证sEVs起源于胆固醇富集的质膜微域。

3.3 sEVs与lEVs在肌肉再生中对肌肉干细胞（MuSC）的拮抗作用

心脏毒素诱导的小鼠胫骨前肌（TA）损伤模型显示，注射对照sEVs（CTR-sEVs）显著增加>30 μm肌纤维数量及肌细胞生成素（MYOG）阳性核比例，促进再生；而TNF-α来源sEVs（TNF-sEVs）无此效应。lEVs（无论对照或TNF-α处理）均增加PAX7阳性MuSC数量但抑制其活化（Ki67阳性率降低）。

离体肌纤维培养实验排除免疫细胞干扰，直接证明sEVs促进MuSC分化（MYOG升高，PAX7降低），lEVs则抑制分化（MYOG降低，PAX7升高）。TNF-α对EVs功能的调控在体内外存在差异，提示其他肌驻留细胞（如免疫细胞）参与体内表型调控。

3.4 sEVs与lEVs调控再生过程中的炎症反应

sEVs（无论对照或TNF-α来源）均增强巨噬细胞迁移能力，但仅CTR-sEVs诱导M1型极化标志物CD86和Il1b表达。体内实验显示lEVs处理降低M2型标志物CD206表达，延缓促炎向抗炎表型转换，而CTR-sEVs维持TNF-α表达，可能通过短暂炎症加速再生。TNF-α削弱sEVs对巨噬细胞M1极化的诱导作用。

3.5 TNF-α通过改变S1P亚型比例影响MuSC分化

靶向脂质组学在SkM-EVs中鉴定出两种鞘氨醇-1-磷酸（S1P）亚型：常见d18:1和非典型d16:1。sEVs中d18:1比例高于d16:1，lEVs则相反。TNF-α处理降低sEVs中d16:1比例，但不影响lEVs。

细胞实验表明高d16:1/d18:1比例上调CCN2（已知抑制MYOG表达并促进成肌细胞增殖），与lEVs处理表型一致。离体肌纤维实验证实高d18:1比例促进MuSC分化（MYOG升高），高d16:1比例则维持干细胞状态（PAX7升高）。巨噬细胞实验中，高d18:1比例促进迁移和M1极化（CD86/Il1b上调），高d16:1比例则抑制这些效应。研究表明S1P亚型比例平衡是调控肌生成和免疫应答的关键分子开关。

4 讨论

本研究揭示骨骼肌EVs主要经由质膜途径产生，sEVs起源于脂筏样微域，lEVs则源于主流质膜。SkM作为长寿命合胞体细胞，EVs释放可能与质膜修复机制（涉及Dysferlin/Annexins/Caveolin-3等ESCRT相关蛋白）及脂质组成调控密切相关。TNF-α通过重塑脂代谢促进胆固醇/SM富集，特异性驱动sEVs生成。

研究首次发现SkM-EVs鞘脂组成（尤其是S1P亚型比例）直接决定其生物学功能：sEVs高d18:1/d16:1比例促进MuSC分化和M1型巨噬细胞应答，加速再生；lEVs高d16:1/d18:1比例则维持Mu干细胞库并延缓炎症消退。d16:1可能通过竞争性拮抗S1PR2受体削弱d18:1信号输出。该发现为靶向EVs鞘脂组成治疗肌营养不良、衰老等MuSC耗竭性疾病提供新思路。