免疫活性肺芯片模型揭示重症流感中IL-1β与TNF-α的拮抗作用及CXCL12-CXCR4轴的关键机制

本期推荐一项突破性研究：为解决重症流感研究中缺乏精准人类免疫反应模型的问题，研究人员开发了免疫活性肺芯片（IC-LOC）系统，成功模拟了人小气道在H1N1感染下的细胞因子风暴、免疫细胞活化及组织损伤等关键病理过程。研究发现IL-1β和TNF-α在炎症启动中发挥拮抗作用，并首次揭示了基质细胞来源的CXCL12通过CXCR4轴调控免疫细胞迁移的核心机制，为靶向免疫失调的治疗策略提供了全新视角。

每年全球有300-500万人罹患重症流感，导致超过30万人死亡，然而现有抗病毒疗法对这类患者效果有限。更棘手的是，当前临床前模型无法准确模拟人类对严重病毒感染的免疫反应，这严重阻碍了我们对疾病机制的理解和治疗策略的开发。动物模型存在显著的物种差异——小鼠与人类在病毒结合受体、肺血管结构和气道尺寸等方面存在根本性区别，而雪貂模型虽然更接近人类病理特征，却面临成本高昂和试剂短缺的困境。传统的二维细胞培养和常规肺芯片（LOC）模型虽然提供了一些见解，但缺乏关键的免疫成分和三维微血管结构，无法再现真实的免疫-基质互作场景。

为了突破这些局限，研究人员在《Nature Biomedical Engineering》发表了一项开创性研究，开发了一种免疫活性、微血管化的人肺芯片设备，成功模拟了人类小气道在重症H1N1感染下的免疫反应。这项研究不仅揭示了白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在细胞因子风暴中的拮抗作用，还首次发现了基质细胞与免疫细胞间的CXCL12-CXCR4相互作用在免疫应答中的关键调控功能。

研究团队采用多种前沿技术方法：通过微流控芯片技术构建三维可灌注微血管网络；整合原代小气道上皮细胞（SAECs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和肺成纤维细胞形成多层结构；从单供体血液中分化巨噬细胞和树突状细胞（DCs）并引入循环免疫细胞；利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析细胞异质性和转录组动态；结合RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）和多重细胞因子分析等技术多维度验证模型可靠性。

研究结果通过多个维度展开：

免疫活性LOC模拟小气道细胞组成

研究人员构建的IC-LOC设备包含空气-液体界面（ALI）分化的气道上皮层和底部的三维可灌注微血管网络。通过免疫荧光染色证实了上皮细胞纤毛标志物TUBB4A和杯状细胞标志物Mucin5AC的表达，表明形成了成熟分化的上皮屏障。微血管网络显示CD31⁺内皮细胞形成管状结构，周围包裹IV型胶原和纤连蛋白构成的细胞外基质（ECM）。研究成功整合了组织驻留巨噬细胞（包括气道巨噬细胞AMs和间质巨噬细胞IMs）、树突状细胞以及循环免疫细胞（PBMCs和全血来源细胞），并证实这些细胞在芯片中保持>90%存活率且未出现显著激活。

在LOC中建立重症流感模型

通过测试不同感染复数（MOI），发现MOI=10能最佳模拟重症流感特征。RNA-FISH显示病毒RNA在感染72小时后显著增加，LOC中平均每个细胞近100个病毒RNA拷贝。病毒毒性实验（Viral ToxGlo）和血凝素（HA）ELISA证实LOC中病毒滴度最高，而上皮损伤标志物乳酸脱氢酶（LDH）活性和上皮通透性测定显示IC-LOC具有保护作用。细胞因子谱分析表明MOI=10能诱导IL-1β、IL-8、TNF-α、CXCL10、IFN-λ1等因子5-400倍的增加，且IC-LOC能重现患者支气管肺泡灌洗液（BAL）中的细胞因子水平。

IC-LOC揭示感染气道的临界结构变化

扫描电镜（SEM）显示感染导致上皮结构严重破坏，紧密连接蛋白ZO-1染色出现显著不规则。免疫细胞的存在减轻了这种损伤，高分辨率成像显示AMs actively摄取病毒颗粒。血管网络分析表明感染使LOC中血管覆盖面积和平均血管长度显著减少，而IC-LOC基本维持了血管完整性。细胞外基质重塑分析发现感染降低了LOC中IV型胶原和纤连蛋白的沉积，IC-LOC则维持了ECM稳态。

IC-LOC展示免疫细胞浸润和病毒摄取

时间 lapse成像发现AMs在感染8小时后体积急剧增大，数量锐减，并与PKH26标记的病毒颗粒共定位（Pearson R=0.79）。病毒信号强度和粒子数量在LOC中最高。PBMCs迁移实验显示感染导致细胞从媒体通道向中央通道迁移显著增加，流式细胞术证实间质中渗出PBMCs比例上升。病毒核蛋白（NP）染色发现IC-LOC间质中存在显著病毒信号，表明免疫细胞参与病毒运输。

重症感染在IC-LOC中诱导系统性细胞因子风暴

多重细胞因子分析显示LOC仅产生适度的细胞因子反应，以IFN-λ2/3为主；M-LOC在气道层产生显著炎症反应但缺乏间质反应；IC-LOC则在气道和间质层均引发广泛细胞因子风暴。scRNA-seq鉴定出15种细胞类型，发现单核细胞是IL-10和IL-1β主要生产者，粒细胞产生IL-8，NK/NKT和T细胞产生IFN-γ、IFN-λ1和TNF。内皮和基质细胞也产生显著水平的IL-10、IL-12和IL-6。

重症H1N1感染改变基质和免疫群体

scRNA-seq显示感染后细胞比例发生 temporal变化：循环免疫群体（T细胞、B细胞、NK/NKT细胞、粒细胞）从对照的83.9%降至感染后的12.5-16.2%，B细胞比例保持或增加，组织驻留免疫群体（AMs、IMs、DCs）略有增加。上皮细胞显著减少，基质和内皮细胞比例增加（源于细胞存活而非增殖）。B细胞是感染设备中最显著增殖的细胞类型。

重症感染增强IC-LOC中基质-免疫互作

感染导致重大转录关闭，中位基因数从对照的2,792降至感染的155-218。215-160个独特基因显著上调（FC>1.5），包括CXCL14、CFD、IFI27等免疫招募相关基因和COL1A1、CCDC80等ECM重组基因。通路分析显示上调基因对应MHC-II抗原呈递、TCR信号、IFN信号和ECM重塑通路。CellChat预测发现感染后与成纤维细胞、CD4⁺T细胞、粒细胞和DCs的互作显著增加。T细胞激活分析显示中央通道CD4⁺T细胞HLA-DR表达增加近3倍，CD8⁺T细胞激活标志物持续增加至感染后7天。

CXCR4、IL-1β和TNF-α抑制改变重症流感进程

CellChat联合流形学习将通路按功能聚类，计算欧几里得距离发现TNF和IL-1通路在感染中失调。抑制实验表明IL-1β抑制剂canakinumab（10μg ml^-1）能独特控制超炎症，而TNF-α抑制剂infliximab（10μg ml^-1）导致抗病毒细胞因子进一步升高。抗病毒药Tamiflu（100μM）对细胞因子反应无益甚至增加IL-1β和GM-CSF。CXCL12-CXCR4轴分析显示成纤维细胞来源的CXCL12是关键配体，感染后间质CXCL12表达显著增加。CXCR4在CD8⁺T和NK细胞中表达上调。CXCR4抑制剂AMD3100（1μg ml^-1）处理恢复循环免疫细胞数量，降低促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-10、GM-CSF）同时增加抗病毒细胞因子（CXCL10、IFN-λ1、IFN-λ2/3、IFN-α2），并显著降低病毒水平。

研究结论强调，这项工作开发的免疫活性肺芯片设备代表了目前最完整的体外人类小气道模型，能够研究呼吸宿主-病原体相互作用、治疗副作用、疫苗效力评估以及系统与黏膜免疫间的交互作用。研究发现IL-1β可能是重症流感超炎症的驱动因子，而TNF-α是上皮细胞因子反应的关键调节因子，CXCR4则是免疫细胞迁移到炎症组织的重要调控轴。这些发现不仅深化了对重症流感免疫机制的理解，也为开发靶向免疫失调的治疗策略提供了新方向，特别是CXCR4抑制剂展现出独特的治疗潜力，能同时增强抗病毒反应并减少组织损伤相关细胞因子。

该研究的局限在于系统缺乏天然血浆、血小板和红细胞，无法研究微凝血或血小板减少症；缺乏真正的次级淋巴器官结构，可能限制B细胞的抗体生成；使用HUVECs而非肺内皮细胞可能略有差异；微血管网络的稳定性限制了研究时长；固定数量的免疫细胞可能夸大免疫细胞死亡程度；所有实验使用单供体免疫细胞，需要进一步评估供体变异性对结果的影响。尽管如此，这项研究为未来探索人类肺-免疫微环境提供了强大的体外模型和研究基础。