液体活检新突破：TGF-β受体与缺氧信号通路相关蛋白组揭示肾癌诊断与机制新见解

本刊推荐：针对肾透明细胞癌(ccRCC)早期诊断标志物匮乏的问题，研究人员通过蛋白质组学分析发现7种血浆生物标志物(ANXA1、ESM1等)组成的诊断模型可实现完美区分患者与健康人群(AUC=1)，并首次揭示TGFBR1与NT5E的蛋白互作关系，为ccRCC液体活检和靶向治疗提供新方向。

肾癌作为全球范围内常见的泌尿系统恶性肿瘤，其中肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)占据了肾癌病例的70%左右，更具有侵袭性强和预后差的特点。令人担忧的是，早期ccRCC通常没有明显症状，导致很多患者确诊时已处于晚期，错过了最佳治疗时机。尽管现代精准医学提倡早期筛查和分子标志物的应用，但针对ccRCC的特异性生物标志物仍然十分有限。此外，ccRCC的肿瘤异质性很高，不同患者的肿瘤在遗传和表型特征上存在显著差异，这为开发新的治疗策略带来了巨大挑战。

在分子机制层面，ccRCC的发生发展与一些关键信号通路密切相关。von Hippel-Lindau(VHL)基因是一个重要的抑癌基因，在ccRCC中经常发生突变。VHL蛋白的正常功能是降解缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)，当VHL发生突变时，HIF-α亚基（包括HIF-1α和HIF-2α）无法被正常降解，导致细胞内缺氧信号通路异常激活，促进肿瘤血管生成和细胞增殖。另一方面，转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路在ccRCC中也扮演着复杂角色，既能抑制早期肿瘤生长，又在晚期肿瘤中促进侵袭和转移。既往研究表明TGF-β信号通路与VHL-缺氧通路之间存在交互对话(crosstalk)，但这种相互作用的具体机制尚不完全清楚。

为了解决ccRCC诊断标志物匮乏的问题并深入探索其分子机制，研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》发表了最新研究成果。研究团队采用多组学方法分析了134例ccRCC患者和111例年龄性别匹配的健康对照者的血液样本和肿瘤组织，结合先进的生物信息学分析和实验验证，不仅发现了具有高度诊断准确性的血浆生物标志物组合，还揭示了TGF-β受体与NT5E蛋白之间的新型相互作用，为ccRCC的诊断和治疗提供了新的见解。

研究采用了几项关键技术方法：使用Olink Target 96 Oncology II PEA-panel（邻位延伸检测技术）对血浆中92种肿瘤相关蛋白进行定量分析；采用随机森林(Random Forest)和弹性网络惩罚逻辑回归(Elastic-Net penalized Logistic Regression, ENLR)等机器学习算法筛选和验证生物标志物组合；通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)技术分析肿瘤组织中信号通路蛋白表达与相互作用；利用免疫荧光染色(Immunofluorescence)和共定位分析研究蛋白在细胞内的空间分布关系；使用相关性分析探讨血浆生物标志物与肿瘤组织蛋白表达之间的关联。所有样本来自临床患者队列，包括配对的血液和肿瘤组织样本。

血浆蛋白质组学分析揭示ccRCC特异性生物标志物

研究人员首先使用Olink PEA技术检测了血浆中92种肿瘤相关蛋白的表达水平。经过质量控制，91种蛋白被纳入分析，其中80种蛋白在ccRCC患者和健康对照之间存在显著差异表达，包括59种上调蛋白和21种下调蛋白。为了评估这些蛋白区分肿瘤样本的潜力，研究团队采用随机森林算法对前50个最显著差异表达的蛋白进行建模，模型通过交叉验证的表现接近100%。

通过系统性地增加模型中蛋白的数量，研究人员发现前7个蛋白（ANXA1、ESM1、FGFBP1、MDK、METAP2、SDC1和TFPI2）足以完美区分患者和健康对照，曲线下面积(Area Under Curve, AUC)达到1.0。值得注意的是，跨膜糖蛋白Syndecan 1(SDC1)与所有临床病理参数均呈强正相关。ESM1、FGFBP1和MDK已知在血管生成和细胞增殖中起重要作用，这解释了它们在ccRCC中的异常表达。丝氨酸蛋白酶抑制剂TFPI2以往被证明是卵巢癌的高度特异性血清标志物，本研究首次发现其在肾癌患者血浆中也有升高。

为进一步验证这7个蛋白标志物的性能，研究人员训练了弹性网络惩罚逻辑回归模型。组合标志物的ENLR模型产生了完美的分类器，显著优于任何单个生物标志物的性能。随机选择的7个蛋白及其组合均不如这7个特选蛋白显著。通过10折交叉验证和保留验证集的内部验证，该组合标志物显示了稳定的高性能。需要指出的是，观察到的AUC为1.0可能受到队列规模限制的影响，更大样本量可能会因变异性增加而降低这一数值。

固体肿瘤分析揭示生物标志物与TGF-β和缺氧信号通路的关联

研究人员之前报道过TGF-β、VHL（在ccRCC中经常突变的抑癌基因）和缺氧(HIF-1α、HIF-2α)信号通路在ccRCC中相互关联，且TGFBR1（TGF-βⅠ型受体）的贡献取决于VHL突变状态。本研究通过探讨同一队列中血浆蛋白水平与固体肿瘤蛋白表达的相关性，重点研究了TGF-β和VHL/缺氧通路中的关键蛋白。

对ccRCC肿瘤中缺氧通路的分析显示，HIF-2A与NT5E和CA9呈正相关。TGF-β通路与NT5E的相关性特别令人感兴趣，因为NT5E正在成为癌症生物学免疫调控中的关键致癌因子，目前有针对NT5E的临床研究正在进行。由于观察到固体肿瘤组织中TGFBR1表达与NT5E呈强正相关，研究人员检测了两种ccRCC细胞系中的内源性基础蛋白水平，以及响应TGF-β刺激和/或HA-TGFBR1瞬时过表达的情况。

值得注意的是，TGF-β刺激786-O和CAKI-1细胞均引起TGFBR1和NT5E的关联。此外，通过免疫共荧光技术研究了CAKI-1细胞中瞬时过表达的TGFBR1与NT5E的可能关联，发现这两种蛋白在细胞膜和细胞质中共定位。研究人员进一步证明，当用TGF-β刺激30分钟时，TGFBR1和NT5E在两种细胞系中均发生共定位，在ccRCC患者的肿瘤切片中也观察到共定位，而在肾皮质组织（正常）切片中则没有。结论是TGF-β刺激ccRCC细胞正向影响NT5E表达，且TGFBR1和NT5E可能在细胞膜和细胞质中形成蛋白-蛋白复合物。

研究结论与意义

本研究通过统计建模将91种血浆蛋白缩减为一个精炼的7种ccRCC生物标志物组合，能够区分健康对照和患者。值得注意的是，这些标志物中许多是分泌蛋白，支持它们作为血浆生物标志物的适用性。此外，通过分析来自同一患者的固体肿瘤样本，研究人员探索了特征蛋白与TGF-β和缺氧/VHL信号通路之间的联系，揭示了若干新颖的关联。

这些发现增强了我们对ccRCC肿瘤生物学的理解，为液体生物标志物的诊断和预后潜力铺平了道路。研究的创新点在于：首次发现7种血浆蛋白组合对ccRCC具有近乎完美的诊断价值；揭示了TGFBR1与NT5E之间的新型相互作用，这可能在ccRCC的发病机制中发挥重要作用；为开发针对TGF-β和NT5E的联合靶向治疗提供了理论依据。

研究的临床意义在于：提供了一种基于血液的非侵入性诊断方法，有助于ccRCC的早期发现和监测；为ccRCC患者分层和个性化治疗提供了潜在生物标志物；针对TGFBR1-NT5E相互作用的治疗策略可能成为ccRCC治疗的新方向。然而，研究也存在一定局限性，如样本量相对较小，需要在更大规模的前瞻性队列中进一步验证生物标志物的性能，并深入探索TGFBR1与NT5E相互作用的分子机制和功能后果。

总之，这项研究不仅为ccRCC的诊断提供了有前景的液体活检方案，还深入探索了TGF-β信号通路与NT5E之间的新型相互作用，为理解ccRCC的分子机制和开发新的治疗策略提供了重要见解。未来的研究可以在此基础上进一步探索这些生物标志物在临床实践中的应用价值，以及靶向TGFBR1-NT5E相互作用的治疗潜力。