脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）暴露通过铁死亡与自噬流紊乱介导肾小管损伤的机制研究

本研究系统揭示了脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）通过诱导线粒体损伤和氧化应激，破坏自噬流（autophagy flux），并进一步引发铁死亡（ferroptosis）和溶酶体功能障碍，最终导致肾小管上皮细胞损伤。研究综合运用蛋白质组学、原子力显微镜（AFM）和透射电镜（TEM）等多技术手段，为DON肾毒性机制提供了新见解，并为相关防治策略提供了潜在靶点。

1 引言

霉菌毒素污染是全球性的食品安全问题，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是谷物和饲料中最常见的污染物之一。人和动物长期暴露于DON可引发多种毒性反应，包括肠毒性、肾毒性和肝毒性。DON具有高生物利用度，可经肠道迅速吸收并分布至多个器官。肾脏作为DON的主要代谢器官，其损伤机制尚未被充分研究。氧化应激是DON诱导肾损伤的主要原因，而这一过程通常伴随自噬流（autophagy flux）的改变。自噬是维持细胞稳态的关键过程，包括自噬体的形成、与溶酶体的融合及内容物的降解。在哺乳动物中，自噬相关基因ATG8（包括LC3和GABARAP等同源物）在自噬过程中起核心作用，其活化需与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，并由ATG4B酶协调调控。此外，活性氧（ROS）水平可影响ATG4B的活性，进而干扰自噬过程。线粒体作为细胞的能量工厂，在清除衰老或受损线粒体的过程中（即线粒体自噬，mitophagy）易产生过量ROS，触发细胞损伤。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，其特征是脂质过氧化和铁离子积聚，而溶酶体在维持细胞内铁稳态中起重要作用。因此，深入研究DON暴露对肾脏自噬流及铁死亡的影响，对于阐明其肾毒性机制具有重要意义。

2 结果

2.1 DON暴露诱导小鼠肾小管损伤

本研究采集了243份饲料样品，包括43份全价饲料和200份饲料原料。分析发现，DON在91.7%–97.8%的饲料原料和100%的全价饲料中被检出（超过100 µg·kg⁻¹即为阳性）。10份全价饲料的DON浓度超过中国饲料安全标准（1000 µg·kg⁻¹），最高浓度达3817.5 µg·kg⁻¹，超标率为23.3%。小麦麸中的DON平均浓度最高（1044.3 µg·kg⁻¹），其次为豆粕（799.1 µg·kg⁻¹）和玉米（748.9 µg·kg⁻¹）。

基于饲料中DON的超标情况，研究对C57BL/6小鼠进行了为期4周的DON灌胃实验。结果显示，DON抑制了小鼠体重增长，增加了肝脏和肾脏的器官系数。高剂量DON暴露导致小鼠血清尿素（Urea）和肌酐（Scr）水平升高，而低剂量组无显著差异。由于肾脏代谢功能强大，Urea和Scr难以早期检测肾损伤，因此研究者检测了肾损伤早期标志物KIM-1的蛋白表达，发现低、高剂量DON均显著升高了肾脏KIM-1水平。H&E染色显示，DON暴露导致肾小管上皮细胞碎片脱落和空泡样变性；Masson染色则提示肾纤维化发生。透射电镜（TEM）观察发现，DON使线粒体体积缩小、双层膜结构模糊，高剂量组甚至出现线粒体周围自噬前体聚集。这些线粒体结构变化与铁死亡过程一致。DON暴露还导致肾脏4HNE（铁死亡标志物）蛋白水平升高，以及氧化应激和脂质过氧化标志物（MDA、SOD和CAT）的改变。此外，DON增加了肾脏TUNEL阳性细胞数，表明其可能诱导细胞死亡。

2.2 DON暴露诱导TCMK-1细胞铁死亡

为探究DON对肾小管上皮细胞的影响，研究者对小鼠肾小管上皮细胞系TCMK-1进行了蛋白质组学分析。共鉴定到1858个蛋白，KEGG分析显示DON处理后程序性细胞死亡相关通路显著富集，包括自噬、线粒体自噬和铁死亡。其中，铁死亡通路尤为显著，DON导致SLC3A2、FTL1、VDAC3和VDAC2蛋白水平下调。免疫印迹进一步证实了SLC3A2和FTL1蛋白的下调，表明DON破坏了X_C-系统功能并促进了铁蛋白降解。此外，DON升高了TCMK-1细胞内ROS水平，降低了抗氧化能力。原子力显微镜（AFM）形态扫描显示，DON处理后细胞膜形成0.4–0.8 µm的突起，可能由脂质过氧化物积累导致膜稳定性下降引起。使用Bodipy C11探针检测发现，DON使探针从还原态转为氧化态，表明脂质过氧化增强。铁死亡抑制剂Liproxstatin-1可缓解DON诱导的细胞形态改变、降低脂质过氧化水平并促进细胞增殖。免疫荧光显示，DON导致细胞变圆，微管蛋白突出于膜表面且无微丝包裹，可能与细胞内Fe²⁺积累导致的膜结构抗氧化能力减弱有关。

2.3 DON暴露导致自噬流阻断和线粒体功能障碍

KEGG分析表明DON暴露导致自噬异常。蛋白质组学显示，DON上调了GABARAPL2蛋白、下调了ATG4B蛋白；免疫印迹证实LC3 I/II蛋白水平升高而ATG4B降低，且LC3 I积累更显著，提示LC3 I向LC3 II转化受阻。使用GFP-mCherry-LC3B探针检测自噬流发现，DON减少了自噬溶酶体（红色斑点）的比例，表明自噬流受损。自噬诱导剂STK683963未能完全恢复DON导致的自噬流障碍，而溶酶体抑制剂氯喹（CQ）在高剂量DON组未能进一步增加自噬体数量，提示DON影响了自噬流的下游过程。TEM显示，DON导致线粒体嵴结构紊乱、体积减小和双层膜结构丢失，低剂量组发现线粒体周围隔离膜出现，高剂量组虽发生线粒体自噬但未清除的异常线粒体数量更多。JC-1和MitoSOX探针检测发现，DON升高了线粒体超氧化物水平、降低了线粒体膜电位并抑制了ATP合成。线粒体外膜蛋白TOMM20和VDAC3水平下调，MitoTracker探针显示线粒体网络受损，进一步证实了线粒体功能障碍。

2.4 MitoTempo不能完全缓解DON诱导的铁死亡

线粒体抗氧化剂MitoTempo未能完全逆转DON暴露引起的4HNE蛋白升高、TUNEL阳性增加和Fe²⁺积累，表明除线粒体氧化应激外，还有其他因素参与TCMK-1损伤。KEGG分析显示，DON触发溶酶体异常，包括LAMP1蛋白上调和LAMP2、CTSB、CTSD蛋白下调。TEM观察到溶酶体积聚，免疫印迹验证了LAMP1升高和溶酶体功能相关蛋白的抑制。DON暴露还导致LAMP2 mRNA水平升高但蛋白水平下降，提示可能存在转录后调控异常。MitoTempo处理后，部分自噬体仍存在，进一步证明DON引起了溶酶体功能障碍。

2.5 DON暴露通过Fe²⁺积累介导溶酶体功能障碍

随着DON处理时间延长，TCMK-1逐渐呈现铁死亡样形态变化。免疫印迹显示FTL蛋白水平随时间逐渐下降，LAMP1蛋白逐渐上升，表明Fe²⁺积累与溶酶体功能受损同步发生。溶酶体功能相关蛋白（LAMP2、CTSB、CTSD）随暴露时间延长而下降，铁螯合剂去铁胺（DFO）可缓解CTSB和CTSD的下降。FerroOrange和LysoTracker探针共染色显示，Fe²⁺随DON暴露时间延长逐渐与溶酶体结合，且溶酶体数量增多，DFO可减少溶酶体数量增加。这些结果提示DON通过铁死亡介导了溶酶体功能障碍。

2.6 DON暴露诱导小鼠肾脏溶酶体功能障碍

体内实验显示，DON暴露升高了小鼠肾脏LC3 I/II蛋白水平、降低了ATG4B蛋白水平，表明自噬起始受阻。同时，LAMP1蛋白表达显著上调，而溶酶体功能相关蛋白（LAMP2、CTSB、CTSD）下调。CTSD和LAMP2缺失会直接影响溶酶体功能和自噬体-溶酶体融合。免疫组化显示CTSD和LAMP2表达与血清肌酐水平呈中度相关。TEM观察到DON暴露小鼠肾脏中溶酶体数量增多，再次证明溶酶体功能受损。

3 讨论

霉菌毒素污染是全球性问题，DON因其高污染率和多种毒性效应受到广泛关注。肾脏作为DON主要代谢器官，其损伤机制复杂，涉及氧化应激、自噬流紊乱和铁死亡等多重过程。本研究首次系统阐明了DON通过抑制ATG4B活性、阻断自噬流，导致受损线粒体积累和ROS过量产生，进而降低细胞对铁死亡的抵抗能力；同时，Fe²⁺向溶酶体聚集引发溶酶体功能障碍，形成恶性循环。这些发现为DON肾毒性提供了新的机制见解，并为防治策略提供了潜在靶点（如调节自噬流或铁死亡通路）。未来研究可进一步探索DON对肠道-肾脏轴的影响，以及其在不同物种中的毒性差异。

4 结论

本研究证实DON暴露通过破坏自噬体形成、抑制线粒体自噬和溶酶体功能，导致线粒体ROS积累和Fe²⁺超载，进而引发肾小管铁死亡和溶酶体功能障碍。该发现揭示了DON肾毒性的多层次机制，为相关疾病的防治提供了理论依据和潜在治疗靶点。

5 实验方法

研究采用体内外结合的方法：体内使用C57BL/6小鼠模型，进行为期4周的DON灌胃；体外使用小鼠肾小管上皮细胞系TCMK-1，通过蛋白质组学、免疫印迹、免疫荧光、TEM、AFM等多种技术手段检测氧化应激、自噬流、铁死亡和溶酶体功能相关指标。数据采用GraphPad Prism进行统计分析，以P < 0.05为显著性标准。所有动物实验均符合中国动物实验管理规范，并经东北农业大学动物伦理委员会批准。