综述：重返未来：脑保护的新纪元

本综述系统回顾了神经保护领域三十年来的失败教训与范式转变，提出"脑保护（Cerebroprotection）"新框架，强调需同时靶向神经血管单元（NVU）中神经元、胶质细胞和血管细胞。作者指出既往研究四大缺陷：过度依赖病灶体积（而非功能结局）、单一靶点策略、实验设计缺陷及严谨性不足，并基于STAIR XI共识提出多维优化方案，为突破脑卒中（Stroke）、全脑缺血及神经退行性疾病的治疗瓶颈提供了全新路线图。

Back Again to the Future: A New Era for Cerebroprotection

Abstract

神经科学领域历经三十年挫折，始终未能将临床前研究中颇具前景的神经保护策略成功转化为有效的临床治疗方案。尽管失败连连，研究者们却仍在沿用相似的理念、方法与策略，未有实质性突破。然而，新近涌现的数据与概念为我们提供了与过去教条决裂、开启研究脑损伤（包括卒中、全脑缺血与神经退行性疾病）保护新纪元的契机。本文提出的“脑保护（Cerebroprotection）”是一个全新的神经治疗设计框架，其保护目标不再仅限于神经元，而是扩展至胶质细胞与血管细胞。

Graphical Abstract

脑保护（Cerebroprotection）这一全新框架旨在设计除神经元外，亦能靶向胶质细胞和血管细胞的神经疗法。未来成功的脑保护策略必将涉及神经血管单元（NVU）的所有组成部分。临床前试验必须包含功能学结局评估和病灶形态学测量。我们必须对临床前研究提出最高标准的严谨性与透明度要求。凭借优化的靶点选择、恰当的终点指标以及提升的科研严谨性，未来的临床试验将有更高几率获得成功。

Flawed Endpoints

在神经保护药物研发的最初几十年，临床前研究过度强调卒中病灶体积的测量。这主要是因为测量病灶形态比评估行为学缺陷和神经功能缺损更为简便和精确。然而，稍作思考便能发现这种对病灶大小的关注存在根本缺陷：临床上，大的脑梗死可能仅导致轻微缺损，而关键部位的小梗死却可能引发灾难性的临床后果。尽管啮齿类动物大脑的拓扑结构不如 gyrencephalic 灵长类动物复杂，其病灶大小与行为学后果的关联性更强，但行为学后果依然不仅取决于梗死大小，也取决于其位置。

领域内许多专业人士对病灶体积测量仍抱有固执的偏爱，因为其测量误差（变异系数）非常小，这使得在实验设计中，为检测合理的治疗效应量所需的事先估算样本量可以更小。此外，病灶体积往往呈正态分布，更易于进行统计分析。我们倾向于不信任那些被视为“较软”的终点指标，例如行为学评分量表，尽管 Likert 量表（多点评分）通常表现出极佳的评价者间一致性。

另一个反对聚焦病灶大小的理由是实用性的：它并未成功。图示分析了七种治疗方法，比较了其在临床前研究中减少病灶体积的百分比与其在大型随机对照临床试验中的比值比（OR）。尽管许多药物在减少病灶体积上效果显著，但仅有组织纤溶酶原激活物（tPA）在临床试验中显示出巨大的获益OR。GABA-A激动剂氯美噻唑、膜稳定剂胞磷胆碱以及远程缺血预适应均在多种动物模型中显示出强大的减小病灶体积效应，但它们的III期关键临床试验均告失败。该图清晰地揭示了动物病灶体积减小与临床成功之间的脱节。

NXY-059的开发使神经保护剂的热情在21世纪初达到顶峰，其临床前研究据称满足了STAIR II建议的严谨性要求。SAINT-1试验提示其有益，但确证性试验SAINT-2的惨败给整个神经保护领域蒙上了阴影。SAINT-2之后的治疗虚无主义在2012年曾因突触后密度蛋白95（PSD-95）抑制剂奈瑞奈特（Nerinetide, NA-1）的研究而有所缓解，其在非人灵长类和人类研究中均显示出减少病灶的效果。然而，该药在随后的三项III期临床试验中均未达到预设终点。

公允而言，图中回顾的大多数药物在临床前动物卒中模型中也显示出行为学获益。但病灶体积减少百分比才是推动这些药物进入临床试验的主要临床前终点和理论基础。关键在于强调动物病灶体积减少与临床试验成功之间的分歧。多数评论者一致认为，未来的临床前试验应强调并具备足够效力来检测治疗对行为学终点的影响，而非病灶体积减少，尽管这会增加成本负担。否则，我们很可能将继续重复转化失败的循环。当然，有必要谨慎选择那些对治疗效应敏感并能准确反映动物真实神经功能缺损状态的行为学终点。

Mistaken Focus on Single Targets

脑缺血启动了一个复杂的级联机制，包括血脑屏障（BBB）破坏、谷氨酸兴奋性毒性、线粒体功能障碍与钙离子内流、自由基损伤以及神经炎症等，最终通过铁死亡（ferroptosis）、坏死（necrosis）、凋亡（apoptosis）、坏死性凋亡（necroptosis）和 parthanatos 等多种机制导致细胞死亡。尽管对此复杂性有广泛认知，但以往研究的每一种卒中治疗都旨在通过靶向缺血级联中的单个机制步骤来阻止缺血；迄今为止，所有单靶点药物均以失败告终。

或许最典型的例子是20世纪80年代提出的谷氨酸兴奋性毒性。谷氨酸拮抗剂MK-801（地佐环平）至今仍是动物模型中研究最多的神经保护剂之一，但数个靶向谷氨酸神经元毒性的临床试验均告失败。与脑保护概念相关的是，有研究表明谷氨酸拮抗剂对星形胶质细胞具有毒性。该领域仍有大量工作待完成。

奈瑞奈特（NA-1）通过干扰PSD-95与谷氨酸受体的耦合来阻断谷氨酸介导的神经元毒性，并减少诱导型神经元一氧化氮合酶（iNOS）的激活，从而可能限制一氧化氮介导的谷氨酸毒性。不幸的是，奈瑞奈特在大型III期试验ESCAPE NA1中失败，尽管在未使用tPA的亚组中观察到获益迹象。随后的ESCAPE NEXT试验强调治疗未同时使用tPA的患者，但也未能显示获益。近期一项对这三项试验的荟萃分析试图确立一个假设：若对非常早期治疗且成功再灌注的患者进行测试，奈瑞奈特仍存希望。

若攻击缺血级联中的单一靶点已多次失败，以至于我们需要寻求新方法，那么组合策略或许可行。组合疗法已在动物中进行尝试，但在人类临床试验中一直被回避。反对组合疗法的一个关键论点来自监管机构，他们要求证明组合疗法中每个独立成分的疗效。首先确认独立疗效，然后证明组合的协同效应，这给临床试验者设置了极高的成本和复杂性障碍。此外，一些同行评审员仍对组合方法持怀疑态度。另一个障碍是制药和设备公司不愿与其他公司合作，担心知识产权和利润分成问题。

为证明未来对组合疗法的投资合理性，需要数据来确定组合疗法是否真的优于单药治疗，更重要的是确定其优越性的机制。组合疗法优于单药治疗仍是一个可检验的假设。在工业界和联邦层面，需要资源来支持针对该假设的基础研究和临床试验。

Inadequate or Inappropriate Experimental Design in Preclinical Modeling

广泛共识认为，在研究推定的脑保护剂时，动物模型应包含相关共病、老龄化和两性数量均衡。这听起来合理，因为卒中患者多为老年人，且患有糖尿病、高血压等影响卒中结局的共病。然而在实践中，这一建议更多是例外而非惯例。

实验设计不当的部分原因在于混淆了实验目的。例如，在卒中细胞分子机制的基础研究中，严格控制生理监测（包括用激光多普勒血流监测确认闭塞成功）可能是可取的，但使用老年或共病模型则非必要。相反，验证新药可能疗效则可能需要更大的样本量和共病动物模型，但监测可更简化以加快工作流程。2021年更新的STAIR建议澄清了动物卒中模型的这两种迥异用途，为研究者规划合适实验设计提供了清晰指引。

临床前动物建模中一个未被充分认识的方面是对速度的需求。有大量待研究的新疗法，并非所有都能进行详尽的剂量反应和治疗时间窗测试。然而，要全面表征一个新的候选治疗药物，需要进行剂量范围研究以确定剂量反应曲线的形状；要具有临床价值，治疗必须在缺血开始后延迟数小时仍然有效。为满足剂量和时间效应研究，可采用几种高通量筛选方法替代全动物大脑中动脉闭塞（MCAo）模型。

氧糖剥夺（OGD）模型，或称“培养皿中的卒中”，可应用于诱导多能干细胞（iPSCs）、类器官、永生化细胞系或原代细胞培养，允许快速测试多种剂量和给药时间。这些模型能以合理成本进行快速测试，但存在局限：细胞培养无法模拟中枢神经系统内细胞类型的交叉对话，缺乏对应血流或外周免疫反应的特征，且不能研究药物在衰老背景下的效应。类器官包含多种不同细胞类型，可用于研究剂量和时间方案，但通常仍缺乏血流（除非在微流体芯片上培养）或模拟衰老效应的能力。新鲜切取的脑片可进行培养并用于OGD范式。老年动物或患有共病的动物可用于脑片OGD模型，但同样缺乏血流和外周免疫反应。所有这些筛选方法都比MCAo模型便宜，但最终，多数权威认为应在MCAo模型中证明治疗疗效，至少使用一个剂量和时间方案，最好有几个，并包含长期（至少30天）行为学结局。

导致先前转化-临床失败的另一个因素可能是对中枢神经系统不同细胞类型的认识不足。神经血管单元（NVU）由几种细胞类型组成，其中研究最多的是神经元、星形胶质细胞、内皮细胞、周细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。在体外细胞培养中，研究表明胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）能很好地抵抗OGD，其次是血管细胞，然后是神经元。在此模型中，通过不同持续时间的OGD应激细胞，试图发现特定细胞类型抵抗力或脆弱性的差异。然而在体内，缺血的结局部分取决于所有细胞类型之间的交叉对话，以及每种细胞类型固有的差异脆弱性。

NVU中的差异脆弱性具有潜在的临床意义。例如，最近一项研究发现，蛋白酶激活受体-1（PAR-1）选择性剂SCH79797在低剂量下保护神经元和星形胶质细胞，但不保护血管细胞，而在较高剂量下则杀死所有细胞类型。凝血酶抑制剂阿加曲班则在不同剂量下均保护所有细胞类型。这些数据说明了跨细胞类型的差异治疗反应，以及忽视差异脆弱性在治疗试验中的潜在危害。

差异治疗反应的另一个例子是，短暂的治疗性低温保护了神经元，但反直觉地抑制了星形胶质细胞。数个研究组已证明星形胶质细胞对神经元的保护作用，包括分泌性或非细胞自主性的神经元保护。延长低温时间抑制了星形胶质细胞的这种保护作用，导致结局恶化。因此，通过忽视NVU中的差异脆弱性和对治疗的反应，先前治疗性低温的试验不仅未能使卒中和心脏骤停受害者受益，反而可能恶化了结局。在一项谷氨酸拮抗剂的临床试验中，星形胶质细胞毒性的证据与结局恶化及死亡率增加的趋势相关。因此，未来的脑保护研究可通过关注NVU中不同细胞类型的差异效应而受益，特别是通过测试对星形胶质细胞的意外效应，这些效应可能消除了活化星形胶质细胞固有的神经元保护反应。

差异脆弱性的分子和细胞机制尚不清楚。可能有几种机制共同导致差异脆弱性，但各自的相对重要性仍有待确定。已知星形胶质细胞储存和利用糖原，这些糖原可能在底物剥夺期间被动员。星形胶质细胞可能通过穿梭乳酸与神经元共享能量，即所谓的星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭假说，尽管这一点仍有争议。星形胶质细胞糖原储备、星形胶质细胞糖原分解以及星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭是否能完全解释观察到的神经元与星形胶质细胞之间的差异脆弱性，或星形胶质细胞对神经元的非细胞自主性保护作用，仍有待证实。除了差异代谢外，还存在许多其他导致缺血期间细胞死亡差异脆弱性的潜在机制。

最近的综述讨论了多种不同形式的细胞死亡，所有这些死亡形式至少发生在神经元和星形胶质细胞中（如果不是所有NVU细胞成分的话）。在响应氧化应激时，神经元和星形胶质细胞在自噬（autophagy）、凋亡、坏死和坏死性凋亡相关通路的相对参与度上存在显著重叠。在所有机制中，铁死亡最近被认为与氧化应激和细胞死亡的联系最为有力。未来研究的一个优先事项将是厘清这些死亡机制在NVU不同细胞类型中的相对贡献。

神经元耐受OGD的时间较短，但在OGD结束时，并非所有细胞都已死亡——额外的细胞死亡发生在模拟再灌注期间。再灌注后的额外细胞死亡被称为缺血再灌注损伤（IRI），并在许多器官中被注意到。通常，IRI与氧化应激相关，再灌注时会发生自由基爆发。氧化还原应激继而触发铁死亡。在铁死亡涉及的众多事件中，脂质过氧化受到了显著关注；几种有毒脂质部分与凋亡的启动有关。

然而，Baron最近对这一范式提出了挑战，认为许多（全部？）被确定为再灌注后的过程实际上在缺血期间就已开始。他还仔细区分了无复流（no-reflow）和再灌注后损伤，而我们大多数人将两者混为一谈。无复流的概念最初是作为一个机械现象被报道的，源于内皮和胶质细胞肿胀。在随后的几十年里，无复流成为远端微血栓堵塞毛细血管的同义词，这促使了数十年抗凝剂的临床试验；这些试验均未成功。随后，血小板聚集和白细胞/毛细血管堵塞成为无复流的主要介质，但临床试验再次失败。Baron指出，无复流与缺血的深度和持续时间密切相关，这表明再灌注前的某些其他事件更可能是罪魁祸首。他进一步挑战了我们所有人都做出的假设，即氧自由基介导了与再灌注损伤相关的大部分损害，并建议应资助该领域进行更多的基础研究。

以上所有内容——包括临床试验的失败，以及对我们公认教条的颠覆性挑战——促使一些人重新思考我们的神经保护方法。基于我们对差异脆弱性的研究，我们提出了细胞特异性靶向，并创造了“脑保护（cerebroprotection）”这一术语。Saver等人提出了一种表征脑保护剂的新方法，其中也考虑了无复流。在这种表述中，作者将其标记为神经保护剂的新分类法，根据靶点和相对于再灌注的时间混合，对脑保护剂进行了区分。该框架是有帮助的，因为它迫使研究者关注非常不同的靶点；例如，再灌注前的桥接脑保护，或再灌注后的再灌注损伤。然而，这些区分是否能转化为有意义的结局差异，仍是一个可检验的假设。我们调整了他们的分类法，以纳入对我们细胞类型特异性差异脆弱性的考量，为未来的脑保护试验提供了一个推测性框架。如果该框架能被验证，未来的临床试验可被设计为根据药物的作用机制来优化细胞保护剂的时机选择和种类选择。此外，该方案允许针对再灌注后不同时间点的不同分子事件进行优化的联合治疗。

Lack of Sufficient Rigor in Preclinical Research

对数据完整性的不当影响可称为偏倚（bias），临床前工作中偏倚的来源已被彻底记录。为克服临床前实验中常见的偏倚来源，科研严谨性的几个方面至关重要。分配隐藏（Concealment）意味着确保进行疾病模型手术的外科医生对分组分配不知情。随机化（Randomization）意味着在疾病模型手术前使用真正的随机化方法分配动物。盲法评估结局（Blinding outcomes）意味着在不知分组分配的情况下进行评估测量。使用CONSORT类型的方法进行动物识别和追踪，可以最小化因忽略或隐藏动物脱落而导致的损耗偏倚（attrition bias）。NINDS资助的SPAN试验开创了严谨性关键实施方式的先河，并表明在多个研究实验室实施最高水平的严谨性是可行的。其他一些小组也尝试了跨多个实验室的严谨性研究，取得了不同程度的成功。SPAN方法的优势在于，一个推定的保护性药物将在多个实验室使用多种动物模型（例如，高血压大鼠和糖尿病小鼠）进行测试。SPAN方法的关键局限在于，这些模型和评估无法使用“金标准”进行验证，因为尚无脑保护剂在人类卒中临床试验中取得成功。在缺乏临床试验成功作为金标准的情况下，这种多实验室网络研究是否必要仍属推测。然而，对绝对严谨性和数据透明度的需求是毋庸置疑的。数个小组已编纂了单实验室研究中严谨性和数据完整性的基本要求。

Target Score Card

众多新型脑保护候选药物正在涌现。其中许多化合物前景广阔，因为它们靶向多个分子事件，从而避免了单靶点问题。此外，其中一些似乎能保护神经元以外的脑细胞类型，尽管专门针对胶质或血管保护进行测试的非常少。有些已在更严谨的设计中并