靶向递送CRISPR/Cas9的TMTP1修饰细胞外囊泡逆转BRAF突变甲状腺未分化癌维莫非尼耐药性并诱导铁死亡

本研究开发了一种新型的TMTP1修饰细胞外囊泡（TMTP1-sgBRAF-EVs）递送系统，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除BRAF突变基因，显著增强甲状腺未分化癌（ATC）对维莫非尼（Vemurafenib）的敏感性。研究首次揭示BRAF缺失通过抑制自噬介导的转铁蛋白受体（TFRC）降解途径，促进脂质过氧化和活性氧（ROS）积累，从而诱导铁死亡（Ferroptosis）的分子机制。该靶向递送系统在体内外均展现出优异的肿瘤靶向性和治疗效能，为克服BRAF突变癌症耐药提供了创新性治疗策略。

引言背景

甲状腺未分化癌（ATC）作为甲状腺癌中最具侵袭性的亚型，虽然发病率较低，但预后极差，患者中位生存期通常不足6个月。其高度侵袭性和快速进展特性使得传统放疗和化疗手段基本无效，患者普遍存在治疗耐药现象。BRAF基因突变（尤其是V600E变异）在ATC中发生频率较高，与肿瘤侵袭性、转移潜能及不良预后密切相关。该突变导致MAPK信号通路持续激活，促进肿瘤细胞生长和存活。虽然BRAF抑制剂维莫非尼（Vemurafenib）在治疗黑色素瘤等癌症中显示出显著疗效，但其对BRAF突变ATC的治疗效果有限，肿瘤细胞会迅速产生耐药性。

铁死亡（Ferroptosis）作为一种铁依赖性和脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式，近年来在癌症治疗领域受到广泛关注。与凋亡或坏死不同，铁死亡通过铁代谢和脂质活性氧（ROS）积累来调控细胞活力。研究表明，维莫非尼能够诱导有效的铁死亡，这是其抗肿瘤作用的关键组成部分。然而，BRAF突变如何影响肿瘤细胞对铁死亡的敏感性，以及其在维莫非尼耐药中的作用机制尚不清楚。

CRISPR/Cas9基因编辑技术因其高效性、精确性和多功能性，已成为研究基因功能和开发基因疗法的重要工具。细胞外囊泡（EVs）作为天然纳米载体，具有低免疫原性和高生物相容性，是药物递送的理想工具。肿瘤转移靶向肽1（TMTP1）能够特异性靶向肿瘤细胞，提高药物递送效率。因此，开发TMTP1修饰的EV系统来递送CRISPR/Cas9基因编辑工具，可能为提高BRAF突变ATC细胞对维莫非尼的敏感性提供新策略。

材料与方法

本研究使用人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1和ATC细胞系（8505c（BRAF^V600E）、BHT-101（BRAF^V600E）、CAL-62（BRAF^WT）和KMH-2（BRAF^WT）进行实验。通过CRISPR/Cas9技术生成稳定的BRAF敲除亚克隆，使用三种不同的sgRNA（BRAF-sgRNA1、BRAF-sgRNA2和BRAF-sgRNA3）插入Lenti-CRISPR v2载体。

细胞外囊泡（EVs）从培养的8505c和BHT-101细胞条件培养基中分离和纯化，通过超速离心法获得。使用透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）对EVs进行表征。通过电穿孔法将Cas9蛋白/sgRNA复合物加载到纯化的EVs中，建立TMTP1修饰的EV系统。

体内实验使用BALB/c裸鼠建立ATC异种移植模型，通过尾静脉注射EVs制剂。通过活死细胞染色、Western blot、RT-qPCR、T7E1 assay等多种技术手段评估治疗效果和机制。

BRAF作为ATC耐药的关键介质

通过对TCGA甲状腺癌数据库的突变数据分析发现，在496例甲状腺癌样本中，BRAF突变占总突变的59%，其中V600E突变效率最高。蛋白水平检测显示，BRAF突变ATC细胞系（8505c和BHT-101）中BRAF蛋白表达显著升高，其中8505c细胞表达水平最高，较正常甲状腺细胞增加179.48%。

维莫非尼处理实验表明，BRAF突变ATC细胞系相比野生型ATC细胞系表现出更强的耐药性。通过CRISPR/Cas9技术成功生成BRAF敲除细胞系后，研究发现与sgNC组相比，sgBRAF-2和sgBRAF-3组细胞活力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力均显著降低，无论是否使用维莫非尼处理。这些结果表明CRISPR/Cas9介导的BRAF敲除能够抑制BRAF突变ATC细胞的耐药反应。

BRAF缺失促进药物诱导的铁死亡

通过转录组测序和KEGG富集分析发现，BRAF缺失后铁死亡相关基因显著富集。实验证实维莫非尼能够诱导脂质过氧化和ROS生成，透射电镜显示经维莫非尼处理的癌细胞呈现铁死亡的形态学特征，如线粒体收缩和膜密度增加。

机制研究表明，维莫非尼显著抑制GPX4和SLC7A11表达，同时增加ACSL4表达。使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1或ROS清除剂NAC能够部分逆转维莫非尼引起的克隆存活损伤。此外，通过持续暴露于erastin和RSL3获得的铁死亡耐药BHT-101和8505c细胞也表现出对维莫非尼的耐药性，进一步证实了铁死亡在维莫非尼抗肿瘤作用中的重要性。

深入研究发现，BRAF缺失增强了维莫非尼在erastin和RSL3耐药的BRAF突变ATC细胞中的疗效。Calcein-AM/PI染色显示维莫非尼处理显著增加细胞死亡，而BRAF缺失进一步增强了这一效应。透射电镜显示BRAF缺失细胞中铁死亡特征更加明显。C11-BODIPY染色表明脂质过氧化在维莫非尼处理后增加，并在BRAF缺失后进一步升高。ROS水平、GSH/GSSG比率、MDA水平和细胞内Fe²⁺浓度等相关指标的变化均证实BRAF缺失促进了维莫非尼诱导的铁死亡。

TMTP1-sgBRAF-EVs作为有效的体内基因编辑递送系统

为解决CRISPR/Cas9体内递送难题，研究团队开发了将Cas9/sgRNA加载到EVs中的方法。Western blot分析显示，EV标志物Alix和TSG101在EV颗粒中富集，而内质网标志物Calnexin未检测到。实验证明癌细胞衍生的EVs优先回到亲代癌细胞，表明肿瘤细胞适合用于肿瘤靶向治疗。

通过电穿孔法将Cas9蛋白/sgRNA复合物加载到分离的EVs中，Western blot证实Cas9蛋白有效加载。TMTP1修饰后，EVs的平均直径从103nm增加到132nm。蛋白酶K和RNase A保护实验证明SpCas9/sgRNA复合物被封装在EVs内部而非仅附着在表面。

TMTP1-sgBRAF-EVs在4°C PBS缓冲液中保存7天或在37°C新鲜血清中放置24小时后均未出现显著聚集，表现出良好的稳定性。Western blot分析显示，TMTP1-sgBRAF-EVs中Cas9蛋白的加载效率接近40%。

TMTP1-sgBRAF-EVs通过促进铁死亡增强维莫非尼敏感性

通过荧光显微镜成像显示，TMTP1-sgBRAF-EVs相比未修饰EVs表现出最高的靶向效率。共培养实验表明，TMTP1-sgBRAF-EVs在8505c细胞中实现了eSpCas9-GFP和sgBRAF-cy3的共定位。

功能实验证明，维莫非尼与sgBRAF或TMTP1-sgBRAF-EVs联合使用显著抑制8505c细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力。Western blot分析显示，TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著降低增殖标志物PCNA、Vimentin和N-cadherin的表达。

Calcein AM/PI染色显示，维莫非尼与sgBRAF或TMTP1-sgBRAF-EVs联合处理显著增加PI阳性细胞数量。透射电镜显示TMTP1-sgBRAF-EVs和维莫非尼联合处理增强了铁死亡形态特征。C11-BODIPY探针染色表明联合处理显著增加脂质过氧化水平。流式细胞术分析显示联合处理显著增加细胞膜上脂质ROS积累。

在BHT-101和8505c细胞中，联合处理显著降低GSH水平，提高脂质过氧化产物MDA水平。FerroOrange探针检测显示联合处理显著增加细胞内Fe²⁺浓度。这些结果表明TMTP1修饰不仅提高了sgBRAF的递送效率，还通过增加氧化应激和铁积累促进靶细胞中的铁死亡。

TMTP1-sgBRAF-EVs通过促进铁死亡显著增强维莫非尼疗效

体内实验通过建立8505c细胞皮下异种移植模型，评估TMTP1-sgBRAF-EVs的生物分布和肿瘤靶向能力。活体成像显示，TMTP1-sgBRAF-EVs组相比未修饰EVs组在肿瘤部位显示更强的荧光信号。离体器官成像表明TMTP1-sgBRAF-EVs组在肿瘤部位具有更强的荧光信号。

肿瘤组织冰冻切片荧光显微镜观察显示，TMTP1-sgBRAF-EVs治疗组肿瘤组织呈现更多GFP、Cy3和DiR荧光，表明TMTP1-sgBRAF-EVs相比其他组具有更优异的肿瘤穿透和积累能力。RT-qPCR显示EV注射后肿瘤中BRAF mRNA水平降低50%以上，Western blot分析结果一致。

T7E1 assay检测显示，TMTP1-sgBRAF-EVs处理产生约50%的NHEJ事件，显著高于sgBRAF单独处理的20%。Sanger测序验证显示TMTP1-sgBRAF-EVs处理的肿瘤组织中sgBRAF靶位点出现明显的重叠峰，表明插入/缺失编辑事件的发生。

肿瘤体积测量显示，维莫非尼和TMTP1-sgBRAF-EVs联合使用比维莫非尼和sgBRAF单独联合更有效，导致治疗期间肿瘤体积统计学显著减少。联合治疗导致GSH水平急剧下降和脂质过氧化产物增加。免疫组化染色显示联合治疗导致BRAF蛋白水平降低，脂质过氧化和铁死亡生物标志物4-HNE显著增加。

安全性评估显示，全身给予治疗相关剂量的TMTP1-sgBRAF-EVs既无毒性也不具有免疫原性，小鼠血液参数、生化特征、体重以及各种细胞因子（IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ）水平均未出现显著变化。

BRAF缺失通过抑制自噬介导的TFRC降解促进铁死亡

基因表达分析发现，在8505c-sgBRAF细胞中，GCLC、SLC39A14/Zip14、FTH1、HMOX1和TFRC表达增加，而SLC40A1和SLC11A2/DMT1减少。RT-qPCR实验证实BRAF缺失显著上调TFRC、FTH1和SLC39A14的mRNA水平，下调SLC40A1和SLC11A2的mRNA水平。

Western blot分析证实，即使用ferrostatin-1或DFO处理48小时，TFRC蛋白表达在BRAF缺失细胞中仍显著上调。使用CHX抑制蛋白质合成评估TFRC蛋白半衰期，结果显示BRAF缺失显著延长了TFRC蛋白的半衰期。

自噬机制研究表明，BRAF缺失细胞中LC3B和自噬受体SQSTM1蛋白表达水平显著高于对照细胞。免疫荧光分析显示BRAF缺失细胞中TFRC与溶酶体标志物LAMP1的共定位减少。用氯喹或巴弗洛霉素A1处理BRAF敲除细胞后，Western blot显示TFRC蛋白积累增加。

这些发现表明，BRAF缺失诱导的铁死亡相关基因表达变化，特别是通过抑制自噬介导的TFRC降解，导致细胞内铁积累增加并促进铁死亡。

TFRC敲低通过抑制铁死亡降低TMTP1-sgBRAF-EVs对ATC细胞的治疗效果

为验证TFRC在TMTP1-sgBRAF-EVs诱导的铁死亡中的作用，研究通过在8505c细胞中敲低TFRC（shTFRC），评估细胞死亡、ROS水平、脂质过氧化、GSH水平、MDA水平和细胞内Fe²⁺浓度。

实验结果显示，TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著增加细胞死亡至60%左右，而TFRC敲低显著减弱这种效应。ROS-Violet610探针检测显示TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著提高ROS水平，TFRC敲低显著降低这一效应。氧化BODIPY-FITC探针评估显示TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著增加脂质过氧化水平，TFRC敲低显著减轻这种增加。

GSH水平测量显示TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著降低GSH/GSSG比率，TFRC敲低显著缓解这种降低。MDA水平检测表明TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著增加MDA水平，TFRC敲低显著减少这种增加。FerroOrange探针检测显示TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著增加Fe²⁺浓度，TFRC敲低显著降低这种增加。

克隆形成实验显示TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著抑制8505c细胞的克隆形成潜力，TFRC敲低显著减弱这种抑制效应。迁移和侵袭实验表明TMTP1-sgBRAF-EVs处理显著抑制8505c细胞的迁移和侵袭能力，TFRC敲低显著减少这些抑制效应。

这些结果共同表明，TFRC在TMTP1-sgBRAF-EVs诱导的铁死亡和增强维莫非尼治疗效果中起关键作用。

讨论与展望

本研究通过整合CRISPR/Cas9基因编辑与肿瘤靶向EV递送系统，全面探索了BRAF在ATC维莫非尼耐药中的作用机制。证明TMTP1-sgBRAF-EVs通过促进铁死亡增强维莫非尼疗效，并首次证实破坏BRAF不仅使ATC细胞对治疗敏感，还通过细胞内铁积累触发铁死亡细胞死亡。

尽管T7E1和测序分析显示sgBRAF组和TMTP1-sgBRAF-EVs组的indel频率分别为20%和50%，但Western blot显示BRAF蛋白几乎完全耗尽。这种中等编辑效率与近乎完全蛋白质丢失之间的差异可归因于多种机制：移码诱导indel触发的无义介导mRNA衰变（NMD）、产生不稳定或无功能的截短蛋白、CRISPR诱导突变后的蛋白质不稳定性增强和蛋白酶体降解，以及Western blot检测的非线性敏感性。

TMTP1-sgBRAF-EVs在中等indel水平下实现BRAF表达的高效功能沉默，与qRT-PCR结果显示BRAF mRNA显著降低一致。这些发现不仅为ATC耐药机制提供了见解，也可能适用于其他BRAF突变癌症。工程化EV系统为基因编辑技术的临床应用指明了新路径，提高了治疗精确性和疗效。

尽管本研究取得重要进展，但仍存在一些局限性。研究主要在体外细胞系和小鼠模型中进行，这些发现的安全性和有效性尚未在临床试验中得到验证。TMTP1修饰EV系统在递送CRISPR/Cas9工具方面显示出前景，但其长期稳定性和潜在免疫反应需要进一步研究。安全性评估对治疗转化至关重要，需要扩展生物分布研究以阐明EV清除率，并确认它们是否优先在肿瘤中积累而不是在脱靶器官（如肝脏）中积累。

本研究专注于BRAF突变ATC，需要进一步研究探索其他类型甲状腺癌的耐药机制。因此，未来研究应扩大样本量并进行更大规模的临床试验，以验证这些发现的普适性和应用潜力。

未来研究应专注于优化TMTP1修饰EV递送系统，提高其体内稳定性和递送效率，同时最小化潜在免疫反应。更大规模的临床试验对于验证该系统在临床应用中的安全性和有效性至关重要。此外，将该递送系统应用于其他类型癌症有助于探索其在不同肿瘤治疗中的广泛适用性和有效性。通过进一步研究和优化，TMTP1-sgBRAF-EVs可能成为肿瘤治疗的多功能工具，为BRAF突变ATC患者提供新的治疗希望，开创癌症治疗新时代。