自体类器官-T细胞共培养平台：建立免疫介导药物性肝损伤（iDILI）的HLA限制性人源化模型

本综述介绍了一项突破性技术：基于iPSC（诱导多能干细胞）的自体肝类器官（HLO）与T细胞共培养平台。该平台成功模拟了HLA-B*57:01限制性、CD8⁺ T细胞介导的免疫性肝损伤机制，为研究药物特异性肝损伤（iDILI）、评估免疫相关不良事件（irAEs）及实现个体化精准安全评估提供了全新的体外建模工具。

引言：填补免疫介导肝损伤研究的体外模型空白

建模适应性免疫反应一直是肝脏研究和药物开发中的关键挑战。免疫介导的肝损伤，包括自身免疫性肝炎、药物超敏反应以及癌症免疫疗法引发的免疫相关不良事件，涉及复杂且患者特异性的机制，而当前的体外系统难以重现这些机制。其中，特异质性药物性肝损伤（iDILI）尤其棘手，它是药物撤市和监管警告的主要原因，也是非过量用药引起的急性肝衰竭的重要诱因。传统肝毒性模型缺乏模拟人类白细胞抗原（HLA）限制性、细胞毒性CD8⁺ T细胞反应所需的抗原呈递机制和T细胞区室，而这些机制在临床iDILI中至关重要。

基质游离HLO微阵列实现均匀且可扩展的培养条件

研究团队采用创新的生物工程方法，通过在水凝胶微腔中强制聚集iPSC衍生的后前肠细胞（Gri3D系统），生成高度均匀且可重复的肝类器官（HLO）。这些水凝胶微腔位于96孔板底部，每个微腔可形成约250个细胞的聚集体。通过预定义的生长因子方案驱动逐步肝脏类器官分化，最终形成具有功能肝细胞（表达白蛋白）和间充质细胞（表达波形蛋白）的三维（3D）类器官。

与标准Matrigel培养相比，Gri3D系统显著提高了细胞培养的均一性，HLO在预定位置形成，供体间重现性高，类器官形成效率和直径一致。功能分析证实，微阵列中的HLO成功成熟，关键肝脏成熟标志物（RBP4、AFP、TTR、A1AT和ALB）的表达水平与Matrigel类器官相当。组织学分析验证了关键肝细胞类型的存在，包括肝细胞（HNF4α、ALB、ASGR1）、肝星状细胞（αSMA）、胆管细胞（CK7）和血管细胞（CD31）。ELISA检测表明白蛋白分泌与传统方法相当。

HLO微阵列准确捕获内在性而非免疫介导的肝毒性

为评估HLO微阵列平台模拟内在性和特异质性DILI的能力，研究测试了两种特征明确的化合物：氯丙嗪（已知引起剂量依赖性内在肝毒性）和氟氯西林（通过需要适应性免疫激活的免疫介导机制诱导iDILI）。

HLO微阵列暴露于七天的重复剂量处理，通过检测细胞ATP含量、DRAQ7阳性细胞（死细胞）计数以及培养上清中白蛋白分泌来评估细胞活力和功能。结果显示，氯丙嗪诱导了显著的剂量依赖性肝毒性，表现为死细胞数量增加、ATP水平降低和白蛋白分泌减少，IC₅₀为14.4 µM，与既往3D肝脏模型一致。相比之下，氟氯西林在所有测试浓度（高达1 mM）下均未显示细胞毒性或功能损伤证据，其水平超过其临床Cmax（≈31 µM）的30倍。

研究还在三个独立的iPSC衍生HLO系中测试了氯丙嗪，其在不同供体中一致诱导剂量依赖性毒性（平均IC₅₀ = 11.12 µM），但易感性程度不同（CV = 40.3%），反映了代谢和药物反应的个体间差异。相反，氟氯西林和链霉素（临床无肝毒性的抗生素）在临床相关暴露下未引发细胞毒性。

自体CD8⁺ T细胞整合建立HLO共培养的免疫能力

为评估患者匹配的T细胞是否能增强HLO微阵列的免疫能力并更准确模拟iDILI机制，研究开发了使用来自同一供体的初始CD8⁺ T细胞的自体共培养系统，并将其与异体共培养系统（HLO与遗传学不同供体的CD8⁺ T细胞配对，引入HLA不匹配）进行比较。

在异体共培养中，在1:1和5:1的效应靶比（E:T）下观察到显著水平的细胞死亡，特别是在T细胞受体（TCR）共刺激下。肝细胞功能（通过白蛋白分泌评估）在TCR共刺激下在两个E:T比下均显著受损。在未刺激条件下，白蛋白分泌仅在较高E:T比（5:1）下降低，表明仅由HLA不匹配驱动的细胞毒性反应需要更大的T细胞群体。此外，颗粒酶B释放仅在5:1 E:T比下在未刺激和抗CD3/CD28处理的异体共培养中显著升高，但在1:1下未检测到，表明异体设置中的T细胞激活和细胞毒性是剂量依赖性的并由TCR共刺激增强。

相反，自体共培养在任何E:T比或TCR共刺激下均未显示显著细胞死亡。然而，在5:1 E:T比下，经抗CD3/CD28的TCR共刺激后观察到白蛋白分泌减少，这可能是由于预期的非特异性T细胞激活和随后的颗粒酶B释放导致肝细胞功能障碍。值得注意的是，在未刺激的自体条件下白蛋白水平保持不变。

HLA-B*57:01限制性CD8⁺ T细胞对氟氯西林的激活

为评估平台的临床相关性，研究使用来自HLA-B57:01携带者和非携带者的患者衍生细胞模拟了氟氯西林诱导的药物性肝损伤（DILI）。氟氯西林是一种β-内酰胺抗生素，是CD8⁺ T细胞驱动的免疫介导肝损伤的明确原因，主要影响HLA-B57:01阳性个体。

从四名HLA-B57:01携带者和四名HLA-B57:01非携带者供体收集外周血样本。为生成抗原特异性CD8⁺ T细胞，研究采用了单核细胞衍生树突状细胞（mDC）启动试验。从每个供体的外周血单核细胞（PBMC）中分离出初始CD8⁺ T细胞和单核细胞。使用IL-4和GM-CSF将mDC分化，然后通过LPS和IFN-γ进行成熟和激活。将成熟的mDC加载氟氯西林或单独培养基，用于启动初始CD8⁺ T细胞。启动后，CD8⁺ T细胞在低剂量IL-15存在下扩增10天，然后进行CFSE标记并在相同条件下用新鲜加载的mDC重新刺激。通过流式细胞术评估CD8⁺ T细胞成熟、增殖和启动后激活。

所有四名HLA-B57:01阳性供体对氟氯西林均表现出一定程度的反应，但仅两名供体显示出强烈的超过2倍的T细胞增殖（CFSE^low细胞）和激活标志物表达相对于单独培养基启动。具体而言，氟氯西林启动导致CD45RO⁺记忆CD8⁺ T细胞群体增加，表达HLA-DR（激活）、CD69（早期激活）和CD137（抗原驱动激活）。此外，CD107a（细胞毒性脱颗粒标志物）的表面表达增加，表明CD8⁺ T细胞响应氟氯西林暴露的特异性功能激活。相比之下，HLA-B*57:01非携带者供体未表现出可比反应，强化了氟氯西林诱导免疫激活的HLA限制性。

类器官-T细胞共培养系统重现HLA-B*57:01限制性氟氯西林诱导肝损伤

为模拟免疫介导肝损伤，将来自三名HLA-B57:01携带者和三名HLA-B57:01非携带者供体的氟氯西林启动的CD8⁺ T细胞与经氟氯西林预处理的自体HLO共培养。与未启动CD8⁺ T细胞的共培养作为对照以排除非特异性T细胞反应性。HLO由供体PBMC衍生的iPSC系生成，并在启动共培养前暴露于100 µM氟氯西林72小时。在成熟第23天，将HLO与未启动或Flux启动的CD8⁺ T细胞共培养以评估免疫介导的肝细胞损伤。通过免疫荧光检测DRAQ7⁺死细胞和测量细胞角蛋白-18（CK-18）释放（早期DILI的高度特异性生物标志物）来量化肝损伤。CK-18是一种在肝细胞和胆管细胞中表达但免疫细胞中不存在的中间丝蛋白，比传统标志物如LDH或ATP具有更高的肝细胞死亡特异性。

来自两名HLA-B57:01携带者供体（534和622；强反应者）的氟氯西林启动CD8⁺ T细胞诱导了显著的HLO损伤，表现为DRAQ7⁺细胞死亡增加4倍（与无T细胞对照相比）和CK-18释放显著升高。该细胞毒性信号与TNF-α和颗粒酶B分泌增加相关，后者是iDILI发病机制的关键介质。相比之下，来自另外两名HLA-B57:01携带者供体（弱反应者）和所有HLA-B*57:01非携带者供体的氟氯西林启动T细胞未能诱导肝细胞死亡或CK-18释放。

结论

这项研究开发了一个可扩展、模块化和自体的肝脏类器官-T细胞共培养平台，用于模拟免疫介导肝毒性。通过整合遗传风险和功能性免疫评估，该系统解决了临床前药物安全性的关键差距，并为机制发现和患者特异性毒性分析提供了一个转化相关框架。