用于HPV驱动癌变分子分诊的现场可部署RotEx-LAMP-LFA平台：实现宫颈癌精准筛查与风险分层

本刊推荐：本研究开发了一种创新的即时检测（POCT）平台RotEx-LAMP-LFA，通过整合微流控核酸提取、快速等温扩增（30分钟，63°C）和侧向流检测，实现了对HPV16/18 E6/E7致癌基因mRNA的精准检测。临床验证显示其对宫颈癌检测灵敏度达94.74%，特异性达100%，且支持自采样与临床采样一致性。该技术突破了传统核酸检测的技术复杂性、长耗时（>4小时）和高成本（>50美元）限制，为资源有限地区的宫颈癌筛查提供了突破性解决方案。

2.1 RotEx-LAMP-LFA：用于宫颈癌风险分层的即时检测平台

HPV E6和E7致癌蛋白的持续表达通过降解肿瘤抑制蛋白（p53和pRb）和诱导基因组不稳定性驱动宫颈癌发生。与当前依赖HPV DNA检测的临床实践不同，E6/E7 mRNA检测能够关键地区分短暂感染与高风险肿瘤进展。为应对全球宫颈癌筛查中的系统性障碍——包括基础设施依赖、侵入性采样和结果延迟——研究团队开发了RotEx-LAMP-LFA平台，这是一个为资源有限环境优化的全集成系统。

传统HPV mRNA诊断需要通过窥器辅助采样由临床医生收集宫颈标本，这一过程与患者不适相关且需要集中实验室基础设施。这些工作流程通常涉及核酸提取、逆转录定量PCR（RT-qPCR）和专用仪器，并将结果延迟数天至数周。这种延迟损害了临床效用，特别是在低收入和中等收入国家（LMICs），其中随访丢失率超过30%。该平台通过四项创新规避了这些限制：1）以患者为中心的自采样：优化用户舒适度和有效RNA保存的阴道自采集装置；2）集成核酸处理：预装冻干试剂和用于从样本中捕获mRNA的磁珠的旋转式卡盒；3）等温扩增：电池供电的加热系统确保持续稳定的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）反应条件；4）可视化风险分层：集成侧向流条带允许临床医生独立解读，测试线强度与病毒载量线性相关。

该系统由一个一次性核酸提取室和一个可重复使用的多功能基座组成，设计用于协调使用，无需电力基础设施或操作员特定技术培训。提取室采用三层聚丙烯结构，顶部密封层具有5毫米孔径用于插入自收集阴道拭子。中间层包含预装冻干试剂（裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液）的扇形隔室，而底层包含用Oligo d(T)25功能化用于序列无关poly(A)+ RNA捕获的顺磁珠。

工作流程始于将拭子插入裂解缓冲液，然后手动旋转室以顺序与试剂室对齐。30°的旋转增量确保准确定位，而2 Hz振荡30秒促进细胞裂解和RNA与Oligo d(T)25包被磁珠的结合，选择性捕获poly(A)+ mRNA，避免基因组DNA污染。集成N52级钕磁铁在缓冲液交换期间固定珠粒，实现无需离心或移液的高效纯化。为确定最佳裂解持续时间，研究比较了1、3、5、7和9分钟裂解后提取的核酸量。基于提取效率和处理时间之间的平衡，5分钟裂解产生最高效率并被选为标准条件。此外，通过处理梯度细胞浓度，评估了RotEx系统的性能并确认其能够从低至1×10³个细胞中高效提取核酸。此外，研究了设备的操作稳健性，结果表明手动摇晃可在合理范围内产生稳定的提取效率。

多功能基座嵌入自调节PTC加热模块，确保芯片上五个不同扩增室的均匀温度，靶向HPV16/18 E6/E7和内控基因GAPDH。通过利用PTC材料的本征电阻变化，该模块在63°C下保持恒定等温条件而无需主动电子反馈。这种被动热调节确保即使在波动功率条件下也能稳定性能。

2.2 集成RT-LAMP检测的系统优化

为识别与肿瘤进展相关的分子标志物，研究靶向了HPV16/18 E6/E7 mRNA的保守区域，其中GAPDH扩增作为样本充分性的内控。选择RT-LAMP是因为其在资源有限环境中的操作优势，将逆转录酶和Bst 3.0 DNA聚合酶结合在单管反应中，实现在恒定温度下RNA-to-DNA转换和指数扩增。

引物设计优先考虑全球HPV变体间的热力学兼容性，使用六组候选引物针对来自PaVE数据库的238个临床分离株进行筛选。引物对P1（HPV16 E6: F3/B3-FIP/BIP）和P2（HPV16 E7: F3/B3-FIP/BIP）表现出100%包容性，可靠检测所有目标变体且无与12种非目标高风险HPV类型的交叉反应性（浓度600 copies μL⁻¹）。荧光动力学显示P1在18.5 ± 2.1分钟内达到HPV16 E6的阈值扩增（ΔF > 0.5），优于次优引物42%。为在保持快速扩增动力学的同时增强灵敏度，使用正交阵列测试系统优化了引物化学计量。最终浓度设定为外引物（F3/B3）0.2 μM，内引物（FIP/BIP）1.6 μM，环引物（LF/LB）0.8 μM，实现了最小化引物二聚体形成和最大化扩增效率之间的平衡。对于现场部署关键的是，该检测展示了宽温度耐受性（60–65°C）且具有等效扩增效率。凝胶电泳证实了在此范围内的 consistent laddering patterns，支持与缺乏精确热控的低成本加热块的兼容性。HPV18 E6和E7的引物筛选和浓度优化遵循了类似的工作流程。通过尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）预处理减轻了污染风险，降解了99.98%的携带扩增子而不损害RNA完整性。

此外，组合检测方案采用差异标记的引物——FAM用于HPV16/18 E6/E7，DIG用于GAPDH——结合biotin-dUTP掺入。DNA聚合酶使用biotin标记的dUTP作为底物促进延伸。该设计使得通过抗-FAM/DIG抗体线同时侧向流检测病原体和控制目标，而biotin-streptavidin相互作用固定AuNP缀合扩增子用于可视化读出的。通过测试线的空间分离和严格洗涤优化消除了检测通道间的串扰。这种系统优化的工作流程平衡了分子特异性、操作稳健性和现场适用性——这是在分散医疗层级实施基于mRNA的宫颈癌筛查的关键要求。

2.3 用于临床可操作风险分层的侧向流条带设计

侧向流条带被设计通过组合捕获架构将分子扩增信号转换为可视化可解读的临床决策。生物素化LAMP扩增子通过高亲和力相互作用与链霉亲和素缀合金纳米粒子（SA-AuNPs）复合，而FAM标记的HPV目标和DIG标记的GAPDH扩增子分别被固定化抗-FAM（TL）和抗-DIG（ICL）抗体捕获。过量SA-AuNPs通过biotin-SA缀合在外控制线（OCL）被隔离，创建了一个三线验证系统，确认检测功能性和样本充分性。测试条的典型可视化结果如图所示。这些结果可基于多个基因目标使用逻辑门操作进行解读。

分析灵敏度通过HPV16/18 E6/E7 mRNA标准的系列稀释（0.06–600 copies μL⁻¹）建立。剂量反应分析揭示了TL强度（通过ImageJ量化）和病毒载量之间的线性相关性（HPV16 E6/E7的R² = 0.96和0.96，HPV18 E6/E7的R² = 0.90和0.97），实现半定量风险分层。此外，邀请了一个十人小组独立解读每个目标在每个浓度下三次重复测试的结果。在5倍系列稀释范围（1.2-750 copies μL⁻¹）内保持了清晰的线性相关性，进一步验证了检测的定量可靠性。对于6至600 copies μL⁻¹的浓度，阳性解读保持一致，而0.6 copies μL⁻¹的结果更加模糊。此外，为统计确定检测的灵敏度，对所有四个目标在6 copies μL⁻¹进行了多次重复，并建立了6 copies μL⁻¹的检测限（LoD）（≥95%阳性检测，40次重复）。具体而言，40次重复中39次为HPV16E6阳性，40/40为HPV16E7，38/40为HPV18E6，39/40为HPV18E7。这种灵敏度水平与FDA批准的Aptima HPV检测相当，但作为POCT平台，该平台消除了对庞大仪器的需求。

使用编码来自14种非目标hrHPV的E6/E7基因的合成质粒（60 copies μL⁻¹）验证了特异性，包括系统发育相关类型HPV31/33/35。未观察到交叉反应性，确认了引物组对HPV16/18的选择性。

在测试细胞样本之前，使用HPV E6/E7 mRNA假病毒 following plasmid construction verification验证了系统。用E6和E7引物扩增标准模板，结果在单独和组合测试条上可视化。使用HPV阳性细胞系的临床前验证进一步证明了临床相关性：SiHa（HPV16+）和HeLa（HPV18+）裂解物在100个细胞/反应时产生稳健的TL信号，而GAPDH扩增确认了所有测试中样本的完整性。上述验证使用已知样本进行，以评估系统RT-LAMP和LFA组件的准确性和可靠性。

2.4 RotEx-LAMP-LFA系统的临床验证

为评估RotEx-LAMP-LFA系统用于宫颈癌筛查的可靠性，使用临床样本验证了其预测准确性，包括自收集阴道分泌物和作为对照的标准方案下医疗专业人员收集的样本。

研究队列包括在医院就诊期间接受标准宫颈癌诊断评估的患者，包括细胞学检查、HPV DNA检测和/或阴道镜检查。如果阴道镜检查发现异常，则进行宫颈活检的组织学检查。根据诊断结果，参与者分为四组：1）肿瘤组：包括HPV DNA 16/18阳性、细胞学发现非典型鳞状细胞未明确意义（ASCUS）或更高且组织学确认宫颈鳞状细胞癌的患者；2）癌前病变组：包括组织学确认宫颈上皮内瘤变（CIN）1-3级的患者；3）HPV感染组：包括HPV DNA 16/18阳性、细胞学正常（无上皮内病变或恶性肿瘤，NILM）且无活检异常的患者；4）健康对照（HC）组：包括所有诊断测试阴性或正常的患者。最终研究队列包括69名个体：19名宫颈癌患者，14例CIN，15名HPV16/18 DNA阳性非癌个体和21名HPV16/18 DNA阴性对照。

此外，使用RT-qPCR作为参考标准检测HPV16和HPV18 E6/E7 mRNA，RotEx系统表现出93.3%的灵敏度（28/30阳性样本正确识别）和100.0%的特异性（39/39阴性样本正确识别），显示两种方法之间近乎完全一致（97.1% (67/69) 准确度）。灵敏度的轻微差异可能源于LAMP固有灵敏度低于RT-qPCR。

RotEx-LAMP系统准确反映了宫颈病变严重程度，实现宫颈癌检测95%（18/19）的灵敏度和癌前病变79%（11/14）的检出率。仅识别出一例无恶性转化的HPV感染病例，而HC组的真阴性率为100%。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，基于HPV E6/E7 mRNA检测的CIN2+风险预测曲线下面积（AUC）为0.94，而HPV DNA检测为0.74。CIN分级反映了上皮异常的程度，CIN2及以上（CIN2+）指示高级别病变，由于其与宫颈癌进展的强相关性而需要临床管理。这些结果表明，基于mRNA的系统能够快速可靠评估宫颈癌风险，并且比DNA方法更少受短暂HPV感染影响。相比之下，15名HPV DNA检测阳性的患者可能接受了不必要的随访程序。RotEx系统有助于减少过度诊断，将非癌检测准确性从58%（21/36）提高到100%（36/36），并将假阳性率从42%降低到0%。此外，当更详细分析癌前病变时，基于mRNA的阳性检出率显示出与CIN分级严重程度相关的趋势——从CIN1的33%，到CIN2的83%，和CIN3的100%——而DNA检测未表现出这种模式。

为评估系统在自采样场景中的性能，收集了四对临床医生收集和自收集样本，并使用集成RotEx-LAMP平台进行了测试。队列包括一名宫颈癌患者（P1），两名癌前病变患者（P2和P3）和一名HC（P4）。结果证明了两种采样方法之间的完全一致性，并准确反映了不同程度的宫颈癌风险，突出了该系统作为POCT工具的潜力。

3 结论与讨论

宫颈癌仍然是一种可预防的疾病，但其全球负担持续存在 due to 可及、准确和及时筛查中的系统性差距——特别是在资源有限的环境中。为应对这些挑战，研究团队开发了RotEx-LAMP-LFA平台——一个集成了以患者为中心的自采样、电池供电核酸处理和快速可视化读出的诊断系统。该平台将oligo d(T)功能化顺磁珠基RNA捕获、RT-LAMP扩增和集成侧向流读出整合到一个流线型工作流程中。关键创新包括用于环境温度扩增的自调节PTC加热模块和一个将分子复杂性编码为简单可视化分诊逻辑的共线侧向流条带。该卡盒采用封闭、用户友好设计，仅需要裂解、混合、孵育和条带插入，使其可由非专家操作并适用于自采样。值得注意的是，同时检测四个HPV E6/E7目标而无需增加程序复杂性，增强了可解读性和诊断稳健性。在配对自收集样本中观察到的完全一致性强调了该平台有潜力减少与临床检测相关的心理压力和财务负担，从而改善资源有限或家庭环境中的筛查可及性和依从性。

通过靶向HPV16/18 E6/E7 mRNA——宫颈癌发生的分子驱动因素——该平台实现临床级准确性（95.6%灵敏度，100%特异性）同时消除对集中实验室和专门培训的依赖。系统的封闭、旋转控制工作流程使用户能够在一小时内完成筛查，总设备成本10–15美元。当前HPV检测方法仍然相对昂贵，这限制了其在资源有限环境中的可扩展性和可及性。研究预期未来大规模制造可能进一步降低单测试成本，促进在低资源临床背景中的更广泛采用。前瞻性队列（n = 69）中的临床验证证明了 robust discrimination of high-grade lesions（AUC = 0.94）和100%特异性区分致癌进展与短暂HPV感染，应对了当前DNA基筛查范式的关键限制。

关键创新包括用于直接mRNA捕获的Oligo d(T)功能化顺磁珠、用于环境温度扩增的自调节PTC加热模块、和一个将分子复杂性编码为可视化分诊逻辑的集成侧向流条带。在配对自收集样本中观察到的完全一致性突出了该平台有潜力显著减少患者与临床就诊相关的心理压力和财务负担，从而改善依从性。

为支持WHO的“90-70-90”宫颈癌消除策略，该系统可能在筛查可及性受限于基础设施和文化障碍的地区发挥关键作用。最初目标是使在资源有限环境（如偏远地区，无法使用大型设备甚至稳定电源）中操作的医疗团队能够进行诊断测试。然而，仍需要在这些环境中进行现场测试以验证平台在不同环境条件下的操作可靠性。虽然当前工作流程设计为可由经过基本培训的人员操作，但研究旨在在未来迭代中进一步简化程序，长期目标是扩展其适用于家庭自测试。

未来努力将聚焦于与国家卫生系统合作实施大规模筛查项目，整合远程医疗平台以协助结果解读，并扩展检测能力以覆盖额外hrHPV基因型。本研究为下一代分散诊断技术提供了清晰蓝图，证明高技术复杂性可与真实世界可用性兼容——这是实现全球肿瘤健康公平的关键一步。

4 实验部分

引物设计与寡核苷酸制备

针对HPV16/18 E6/E7转录本的LAMP引物使用PrimerExplorer V5设计。GAPDH引物从验证来源适配。所有寡核苷酸由Sangon Biotech合成，溶解在无核酸酶TE缓冲液（pH 8.0）中至10 μM，并储存于–20°C直至使用。

RT-LAMP扩增

使用WarmStart^® LAMP Kit进行RT-LAMP。反应包括0.2 μM外引物（F3/B3），0.8 μM内引物（FIP/BIP），和20 μM Biotin-11-dUTP用于侧向流兼容性。在63°C下进行扩增30分钟 on a LightCycler 480 II以监测动力学。产物在4°C储存最多24小时以供进一步分析。

RT-qPCR定量

使用商业RT试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，随后使用Takara qPCR Mix进行qPCR。在LightCycler 480 II上监测扩增，并记录Ct值。

电泳验证

将RT-LAMP产物与DNA上样缓冲液混合，并在10%天然PAGE上电泳。用GelRed™染色并使用Gel Doc EZ系统与Image Lab v6.1可视化。

特异性测试

使用编码来自14种高风险HPV基因型的E6/E7基因的合成质粒测试检测特异性。质粒在TE缓冲液中稀释至40 ng μL⁻¹并保持于–20°C。

侧向流检测

对于可视化检测，将2 μL生物素化产物应用于具有链霉亲和素和捕获探针的侧向流条带。将条带在100 μL缓冲液中孵育3分钟。上控制线确认LFA有效性，内线确认样本处理，测试线指示目标检测。

假病毒和细胞模型

HPV16/18 E6/E7假病毒从中国国家计量院获得并储存于–80°C。SiHa和HeLa细胞系由MeisenCTCC提供并在标准条件下培养。

RNA提取方法

使用Oligo d(T)包被磁珠提取mRNA。样本裂解，与珠粒孵育杂交，顺序洗涤，并在平衡后在洗脱缓冲液中洗脱。为DNA污染比较，也按照制造商方案测试了RNA Easy Fast Tissue/Cell Kits。

临床标本处理

本研究经上海仁济医院伦理委员会批准，并在收集临床医生收集和指导自收集阴道拭子样本前获得所有参与者书面知情同意。总共69个临床医生收集拭子在常规检查期间获得并放入含有保存溶液的管中。此外，4名参与者被指导使用HPV试剂盒进行自收集。所有标本在2小时内处理并储存于–80°C直至分析。

样本检测过程如下：首先将收集的拭子在RotEx提取室的第一个扇区中洗脱。然后手动旋转室以使磁珠顺序接触不同试剂，随后手动摇晃以完成样本提取。每个扇区中的试剂分布如图所示。在此过程中，将提取室放置在设备基座上的指定位置，其中嵌入基座的磁铁促进磁珠沉淀。这使得能够进行逐步方案包括裂解、洗涤、平衡和最终洗脱。提取后，将室倒置并与扩增芯片对齐用于后续RT-LAMP反应。一旦对齐，启动等温加热模块以开始扩增。完成后，将侧向流条带浸入反应产物溶液中进行可视化读出的。

对于通过RT-qPCR进行mRNA检测，取涡旋混合后拭子保存溶液的一部分。按照上述程序提取总mRNA，然后逆转录为cDNA，随后使用qPCR进行荧光信号监测。

统计分析

所有临床数据使用GraphPad Prism version 9.5.0分析。数据表示为至少三个独立生物学重复的平均值±SD，除非另有说明。使用未配对、双尾Student's t-test进行两组间比较。样本大小（n）指独立生物学重复，并在图例或相关方法小节中报告用于每个分析。通过绘制受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断性能，计算AUC、准确度和灵敏度。使用Wald和Wilson方法确定比例估计的置信区间。p值小于0.05被认为具有统计显著性。