TIMP2通过Wnt/β-catenin信号通路诱导肾小管适应不良修复和细胞衰老促进急性肾损伤向慢性肾病转变的机制研究

本研究揭示了组织金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP2）在急性肾损伤（AKI）向慢性肾病（CKD）转变过程中的关键作用。通过多模型验证发现，TIMP2通过结合Wnt共受体LRP6并促进其磷酸化，以基质金属蛋白酶（MMP）非依赖性方式激活β-catenin信号通路，进而诱导肾小管细胞衰老和适应不良修复。遗传学干预实验证实，特异性敲除TIMP2可显著改善肾功能并延缓纤维化进展，提示其不仅是生物标志物，更是潜在治疗靶点。

1 引言

急性肾损伤（AKI）是临床常见危重症，其向慢性肾病（CKD）的转变机制尚未完全阐明。肾小管上皮细胞（RTECs）在损伤后经历适应不良修复过程，表现为细胞衰老、线粒体功能障碍和纤维化重构。TIMP2作为AKI的尿液生物标志物，其直接参与AKI-CKD转变的致病机制仍有待揭示。Wnt/β-catenin信号通路在肾脏修复中起关键作用，但其与TIMP2的调控关系尚未明确。

2 研究结果

2.1 TIMP2在AKI-CKD模型中被诱导表达

通过人类肾脏空间多组学图谱分析发现，TIMP2在损伤肾小管区域显著富集，且与衰老标志物CDKN1A分布高度一致。在小鼠UIR（单侧缺血再灌注）、UUO（单侧输尿管梗阻）和顺铂肾病模型中，TIMP2在肾小管中呈现时间依赖性上调，尤其在Cdh16⁺远曲小管和AQP2⁺集合管中表达最为显著。

2.2 TIMP2基因缺失改善适应不良修复

采用肾小管特异性诱导性基因敲除模型（Ksp-CreERT2; Timp2^fl/fl）发现，TIMP2缺失显著改善肾小球滤过率（GFR），降低肾损伤分子-1（KIM-1）表达，减少去分化标志SOX9⁺细胞数量，同时保留肾小管刷状缘标志LTL⁺表达，表明TIMP2缺失促进适应性修复。

2.3 TIMP2缺失减轻纤维化损伤

组成性基因敲除模型（KspCre; TIMP2^fl/fl）显示，TIMP2缺失显著降低胶原沉积和α-SMA⁺肌成纤维细胞活化。在原代肾小管上皮细胞（PRTCs）中，TIMP2缺失减轻钴氯化物（CoCl₂）诱导的上皮-间质转化（EMT）标志物表达。

2.4 TIMP2缺失缓解细胞衰老和线粒体功能障碍

转录组分析显示TIMP2缺失下调衰老相关基因富集通路。SA-β-gal染色和Western blot证实P21、γH2AX等衰老标志物表达降低。电镜观察发现TIMP2缺失组线粒体嵴结构更完整，使用衰老清除药物ABT-263可模拟TIMP2缺失的保护效应。

2.5 TIMP2通过MMP非依赖性机制调控细胞衰老

体外实验证实，重组人TIMP2（rhTIMP2）及其突变体rhAlaTIMP2（缺乏MMP抑制功能）均能促进细胞衰老和纤维化标志物表达，表明该过程不依赖MMP抑制功能。线粒体形态学分析显示TIMP2缺失维持线粒体网络完整性。

2.6 TIMP2通过β-catenin信号通路促进细胞衰老

免疫荧光显示TIMP2与β-catenin在损伤肾小管中共定位。TIMP2缺失显著抑制LRP6磷酸化和下游Snail1、Cyclin D1表达。TopFlash报告基因实验证实TIMP2增强β-catenin转录活性。

2.7 TIMP2通过促进LRP6磷酸化调控Wnt/β-catenin通路

蛋白互作预测和Co-IP实验验证TIMP2与LRP6直接结合，关键位点K155A突变可破坏该相互作用。磷酸化缺陷型LRP6突变体（MUT-pLRP6-ser1490）可阻断TIMP2对β-catenin通路的激活。

2.8 TIMP2过表达加剧肾纤维化

腺相关病毒（AAV）介导的TIMP2过表达显著加重纤维化和细胞衰老。使用β-catenin抑制剂ICG-001可逆转TIMP2过表达引起的病理改变，证实该过程的通路依赖性。

3 讨论

本研究首次揭示TIMP2通过直接结合LRP6受体，以MMP非依赖性方式激活Wnt/β-catenin信号通路，驱动肾小管细胞衰老和适应不良修复。遗传学干预实验证明靶向TIMP2可有效延缓AKI-CKD转变，为临床防治提供新策略。

4 材料与方法

实验采用8-12周龄雄性小鼠，通过肾小管特异性Cre/LoxP系统构建基因敲除模型。肾功能通过经皮GFR监测系统动态评估。统计学分析采用GraphPad Prism 10软件，组间比较使用双因素方差分析。