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本文介绍了一种名为SpliCOOL-seq的高通量单细胞多组学测序技术，可同步检测全基因组DNA甲基化（WCG）和染色质可及性（通过GCH甲基化水平间接反映）。该技术通过整合原位GpC甲基化、通用Tn5转座酶标签化和组合索引策略，显著提升了检测灵敏度和通量。研究团队应用该技术解析了肺癌细胞（如A549、H460、SK-MES）及原发性肺腺癌（LUAD）组织的表观遗传特征，发现DNMT抑制剂（5-氮杂胞苷、地西他滨）可诱导大规模去甲基化但模式各异，并鉴定出与患者生存相关的新型甲基化生物标志物（如FAM124B、SFN、OR7E47P）。此外，研究揭示了肿瘤亚克隆中表观遗传年龄加速和有丝分裂活动增强的现象，为肺癌发生机制和精准诊疗提供了新见解。
技术原理与优势
SpliCOOL-seq通过原位GpC甲基化处理细胞核，保留染色质结构后，利用甲醛固定并进行SDS介导的核小体去除。随后采用通用Tn5转座酶复合物进行标签化，避免不同条形码Tn5活性差异导致的覆盖偏差。通过两轮连接反应引入组合条形码，最终经亚硫酸盐转化、随机引物延伸和PCR扩增构建文库。与sciMET等现有技术相比，该方法显著提升读长映射率（69.3%–87.6%）和单细胞CpG位点检测数量，且在物种混合实验中双胞率低于5%，支持万级细胞通量分析。
肺癌细胞表观遗传图谱构建
研究对1310个肺癌细胞（A549、H460、SK-MES）进行多组学分析，平均每个细胞检测46.3万条唯一读长、19.4万个WCG位点和168.9万个GCH位点。结果显示：
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启动子区域特征：所有细胞在转录起始位点（TSS）均呈现WCG低甲基化，而基因体部甲基化水平最高；A549细胞在全基因组甲基化水平较低，但基因侧翼区域甲基化显著升高。
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多模态聚类：基于250 kb窗口的WCG和GCH甲基化数据，可清晰区分三种细胞类型。整合加权最近邻（WNN）分析进一步验证聚类准确性，且DNA甲基化数据在细胞分型中表现更优。
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染色质可及性验证：通过scATAC-seq比对，发现细胞类型特异性NDR与差异可及区域高度重叠，且富集转录因子 motifs（如GATA1/12/14）一致，证实SpliCOOL-seq可精准捕获开放染色质区域。
DNMT抑制剂的差异化去甲基化模式
用5-氮杂胞苷（5-Aza）或地西他滨（DEC）处理A549细胞1–5天后发现：
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全局去甲基化：5-Aza组第5天全球WCG甲基化水平从48.03%降至32.94%，DEC组降至25.13%，但染色质可及性未同步改变。
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动力学差异：5-Aza诱导渐进式去甲基化，而DEC处理第3–5天时高/低甲基化位点数量平衡，导致整体水平稳定。
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肿瘤抑制基因（TSG）重编程：21个高甲基化TSG在5-Aza处理后去甲基化，DEC组涉及17个TSG，仅5个基因（如KANK1）为共有靶点。聚类分析将差异甲基化区域分为6类，其中C4区域（含DAB2IP、PAX6）在治疗初期即去甲基化，提示其作为早期疗效标志物潜力。
原发性肺腺癌的肿瘤异质性解析
对肺癌组织原发灶（PT）和癌旁组织（AT）的840个细胞分析显示：
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拷贝数变异（CNV）分型：细胞分为四类——原发癌亚克隆（PC1、PC2，CNV丰度高）、癌旁正常细胞（AN，二倍体型）、癌旁癌化细胞（AC，少量CNV）。AC细胞散布于PT/AT区域，表观特征接近AN细胞，或代表早期癌变群体。
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表观年龄加速：基于TCGA数据训练的scAge模型显示，PC1/PC2克隆的DNA甲基化年龄显著高于AN细胞，且与Hannum、Horvath2等表观遗传时钟标记位点重叠。
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有丝分裂时钟激活：epiTOC模型分析表明，PC与AC克隆的细胞分裂率（CDR）显著升高，印证异常甲基化在有丝分裂中累积的理论。
新型生物标志物与治疗靶点发现
通过整合多组学数据鉴定出多个LUAD相关标志物：
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生存关联基因：启动子低甲基化的SFN与患者不良预后相关，其敲除可抑制A549细胞增殖/迁移；FAM124B、OR7E47P等基因甲基化水平与生存期显著相关。
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通路富集：AC细胞特异性去甲基化基因富集于分解代谢过程，PC细胞偏好感官嗅觉通路（如OR7E47P），高甲基化基因均与翻译抑制相关。
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功能验证：SFN敲除后，RNA-seq显示FGF2、MAP4K4等促癌通路基因下调，细胞增殖/侵袭能力受阻，提示其作为联合治疗靶点潜力。
技术局限与展望
SpliCOOL-seq虽显著提升多组学检测能力，但仍存在局限：原位GpC甲基化效率低于裸露DNA，核小体去除步骤导致75%细胞损失，且GCH标记在神经组织中适用性有限。未来可通过优化核固定策略、开发神经特异性方案进一步拓展应用场景。该技术为解析肿瘤表观遗传进化、筛选液态活检标志物及开发靶向疗法提供了强大平台。
