KNTC1/E2F8/MYC正反馈环路驱动膀胱癌发生与吉西他滨耐药的新机制与治疗策略

本研究发现膀胱癌（BLCA）中KNTC1（Kinetochore-associated 1）显著上调并与患者不良预后相关。研究揭示KNTC1通过与转录因子E2F8结合并促使其核转位，进而激活MYC转录，而MYC又能反馈性上调KNTC1，形成正反馈环路，并共同驱动致癌性PI3K/AKT/mTOR通路过度活化，从而促进BLCA肿瘤发生、转移及吉西他滨（Gem）耐药。研究还开发了一种基于聚（β-氨基酯）（PAE）的纳米载体递送KNTC1 siRNA（PAE@shKNTC1），在临床前模型中有效抑制了肺转移。该工作不仅将KNTC1确立为预后生物标志物，更揭示了其作为治疗靶点的潜力，为克服BLCA化疗耐药提供了新策略。

研究背景

膀胱癌（Bladder Cancer, BLCA）是一种致死率高的恶性肿瘤，常面临化疗耐药和治疗选择有限的挑战。动粒相关蛋白1（Kinetochore-associated 1, KNTC1）虽在多种癌症中被提及，但其在BLCA中的确切作用、调控机制及治疗潜力尚未明确。本研究旨在深入探究KNTC1在BLCA中的功能与机制。

KNTC1在BLCA中高表达且与不良预后相关

通过对公共数据库（TCGA, GEO）及临床样本的分析，研究发现KNTC1在BLCA组织中无论是mRNA还是蛋白水平均显著上调。生存分析显示，KNTC1高表达与患者较差的总生存期（OS）密切相关，提示其作为预后生物标志物的潜力。

KNTC1在体外和体内促进BLCA细胞的恶性表型

在体外实验中，敲低KNTC1（sh-KNTC1）抑制了BLCA细胞（UMUC3， T24）的增殖、迁移、侵袭能力，并诱导G₂/M期周期阻滞。而过表达KNTC1（OE-KNTC1）则促进了低表达细胞（5637， HT1197）的这些恶性行为。在裸鼠皮下移植瘤模型中，瘤内注射sh-KNTC1能显著抑制肿瘤生长和重量，并降低增殖标志物Ki67的表达。

机制探究：KNTC1通过调节PI3K/AKT/mTOR/MYC信号通路发挥作用

对KNTC1敲低细胞进行RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）发现，差异表达基因显著富集在“PI3K/AKT/mTOR信号通路”和“MYC靶标”通路中。实验证实，KNTC1的敲低或过表达能相应地下调或上调MYC的mRNA和蛋白水平。此外，KNTC1敲低降低了AKT（Thr³⁰⁸）、mTOR（Ser²⁴⁴⁸）和p70S6K（Thr³⁸⁹）的磷酸化水平，而过表达KNTC1能部分逆转PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂BEZ235的抑制作用。这些结果表明KNTC1通过激活PI3K/AKT/mTOR通路并调控MYC来促进BLCA的恶性行为。

KNTC1与E2F8相互作用并促进其核转位以激活MYC转录

为探究KNTC1如何调控MYC，研究通过免疫共沉淀联合质谱（Co-IP/LC-MS）等技术，发现转录因子E2F8是KNTC1的关键结合蛋白。Co-IP和邻近连接实验（PLA）进一步证实了二者的直接相互作用。GST pull-down实验确定了相互作用的蛋白结构域。有趣的是，KNTC1并不影响E2F8的总蛋白表达，但能促进其从细胞质向细胞核的转位。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证明，E2F8可直接结合到MYC的启动子区域。因此，KNTC1通过充当“分子伴侣”，将E2F8“护送”入核，从而增强E2F8对MYC的转录激活。

E2F8在体外和体内驱动BLCA进展

功能实验证实，敲低E2F8抑制了BLCA细胞的增殖、侵袭、迁移和细胞周期进程，而过表达E2F8则产生相反效果。在裸鼠皮下移植瘤模型中，瘤内注射si-E2F8能有效抑制肿瘤生长并降低Ki67表达，证明了E2F8在体内的促瘤作用。

MYC正向调控KNTC1转录，形成正反馈环路

研究进一步发现，MYC不仅是KNTC1的下游靶点，也能作为上游调控因子。敲低MYC会降低KNTC1的表达，而过表达MYC则会上调KNTC1。通过JASPAR数据库预测、ChIP-qPCR以及双荧光素酶报告基因实验，研究证实MYC能够直接结合到KNTC1的启动子区域并激活其转录。这就构成了一个“KNTC1-E2F8-MYC”正向反馈环路，双方相互促进，持续放大致癌信号。此外，MYC的过表达能逆转PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂的作用，而KNTC1的过表达也能逆转MYC敲低对该通路的抑制，表明该环路共同驱动了PI3K/AKT/mTOR通路的过度活化。

靶向KNTC1和MYC可克服吉西他滨耐药

生物信息学分析显示，KNTC1高表达与吉西他滨（Gem）敏感性降低相关。在构建的吉西他滨耐药细胞（UMUC3/GR， T24/GR）中，KNTC1、E2F8和MYC的表达均显著上调。KNTC1敲低能降低耐药细胞的半数抑制浓度（IC₅₀），增加其对吉西他滨的敏感性。更重要的是，KNTC1敲低与MYC抑制剂（10058-F4）联用，在体外和体内均显示出比单一处理更强的抑制耐药肿瘤生长的协同效应。

基于PAE的纳米载体递送sh-KNTC1有效抑制肿瘤转移

为实现KNTC1的靶向治疗，研究合成了一种基于聚（β-氨基酯）（PAE）的纳米载体，用于递送sh-KNTC1（PAE@shKNTC1）。该纳米颗粒粒径均一，能有效负载shRNA。在BLCA肺转移裸鼠模型中，尾静脉注射PAE@shKNTC1能显著降低肺转移灶的生物发光信号和结节数量，且未观察到明显毒性，证明了该纳米递送系统的治疗潜力和安全性。

总结与展望

本研究系统阐明了KNTC1在膀胱癌中的核心作用。它通过与E2F8结合并促进其核转位来激活MYC，而MYC又反馈性上调KNTC1，形成一个强大的正反馈环路。该环路驱动PI3K/AKT/mTOR信号通路过度活化，从而促进肿瘤发生、进展及吉西他滨耐药。KNTC1不仅是一个有价值的预后标志物，更是一个有潜力的治疗靶点。针对KNTC1的基因沉默疗法，尤其是与MYC抑制剂的联用策略，以及基于PAE纳米载体的靶向递送系统，为克服膀胱癌化疗耐药和抑制转移提供了新的治疗思路。