蜕膜巨噬细胞介导滋养层细胞铁死亡导致复发性自然流产

复发性自然流产（RSA）对早期妊娠成功构成重大挑战，而滋养层细胞铁死亡是RSA的重要致病机制。然而，作为母胎界面关键免疫调节因子的蜕膜巨噬细胞，是否参与调控滋养层细胞铁死亡仍不明确。本研究观察到RSA患者及流产小鼠胎盘滋养层细胞中存在显著铁死亡。转录组测序结果显示，来源于RSA患者的蜕膜巨噬细胞可显著促进滋养层细胞铁死亡，并同时损害滋养层细胞功能。在机制层面，沉默滋养层细胞中的血红素加氧酶1（HMOX1）可有效逆转铁死亡，并恢复被RSA患者来源蜕膜巨噬细胞抑制的滋养层细胞功能。值得注意的是，蜕膜巨噬细胞通过分泌C-X-C基序趋化因子配体2（CXCL2）调控滋养层细胞铁死亡及其功能。此外，与RSA患者来源蜕膜巨噬细胞共培养的滋养层细胞中，核因子κB（NF-κB）通路显著富集。进一步的回复实验表明，CXCL2/NF-κB/HMOX1信号轴可能是蜕膜巨噬细胞在RSA中调控滋养层细胞铁死亡及功能的关键机制。后续研究进一步证实，与RSA来源蜕膜巨噬细胞共培养的滋养层细胞可促进巨噬细胞促炎极化。该效应由白细胞介素-6（IL-6）缺乏介导，并通过抑制Janus激酶2（JAK2）/信号转导及转录激活因子3（STAT3）信号轴实现。最后，药理学分析显示，圣草素（Eriodictyol）在RSA中表现出与CXCL2轴相关的保护作用。总之，研究人员观察到RSA患者蜕膜巨噬细胞可诱导滋养层细胞铁死亡，提示靶向该机制可能为重塑母胎耐受提供新的干预机会。

《iMeta》发表的这项研究围绕复发性自然流产（RSA）的母胎界面免疫失衡展开，聚焦蜕膜巨噬细胞与滋养层细胞之间的双向串扰及其在铁死亡（ferroptosis，一种依赖铁离子并伴随脂质过氧化累积的调控性细胞死亡）中的作用。RSA是女性生殖健康中的重要难题，其病因复杂，且相当比例病例病因不明。既往研究已提示滋养层细胞功能障碍与RSA密切相关，尤其是滋养层细胞铁死亡可能参与胚胎着床失败、胎盘形成异常及母胎循环建立障碍。然而，上游诱导因素尚未完全明晰。蜕膜巨噬细胞是母胎界面最重要的免疫细胞之一，维持适当的M1/M2极化平衡对妊娠成功至关重要。研究人员因此提出，有必要从母胎界面免疫微环境角度，系统阐明蜕膜巨噬细胞是否通过特定信号通路诱导滋养层细胞铁死亡，并由此推动RSA发生发展。

在研究设计上，研究人员联合临床样本、细胞共培养体系、转录组测序和流产倾向小鼠模型，对这一问题进行了分层验证。临床部分纳入15例RSA患者和15例正常妊娠者，获取绒毛及蜕膜组织，并分离CD14阳性蜕膜巨噬细胞；体外使用原代蜕膜巨噬细胞与HTR-8/SVneo滋养层细胞共培养，结合RNA-seq、qRT-PCR、Western blot、ELISA、免疫荧光、流式细胞术以及CHIP-qPCR和双荧光素酶报告实验分析分子机制；体内采用CBA/J×DBA/2流产模型与CBA/J×BALB/c正常妊娠模型，并通过AAV9介导基因沉默、药物抑制及天然化合物干预进行验证。技术主线可概括为“临床观察—机制挖掘—体内外回复验证—药理干预评估”。

**Ferroptosis is observed in the villous tissue of patients with RSA**
研究首先在临床绒毛组织和小鼠胎盘界面验证铁死亡是否客观存在。结果显示，RSA患者绒毛组织中谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性下降，而Fe²⁺和丙二醛（MDA）升高，提示抗氧化能力下降并伴随脂质过氧化增强。分子层面，促铁死亡蛋白酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和转铁蛋白受体1（TFR1）上调，而抑铁死亡蛋白溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）下调。小鼠流产模型中同样观察到上述变化，且胎盘界面铁死亡指标与胚胎吸收率呈显著相关。该部分说明RSA相关胎盘滋养层细胞中确有显著铁死亡发生，并与不良妊娠结局密切相关。

**Decidual macrophages derived from patients with RSA cause ferroptosis in trophoblasts**
随后，研究人员通过原代蜕膜巨噬细胞与滋养层细胞共培养，考察RSA来源蜕膜巨噬细胞是否直接影响滋养层细胞。RNA-seq显示，共培养后滋养层细胞差异表达基因显著富集于铁死亡通路。功能检测进一步表明，RSA来源蜕膜巨噬细胞可增加滋养层细胞内活性氧（ROS）、线粒体超氧（mitoSOX）及脂质过氧化水平，降低线粒体膜电位，同时引起GSH和GPx活性下降、Fe²⁺和MDA升高，并导致ACSL4、TFR1上调及SLC7A11、GPX4下调。除铁死亡外，滋养层细胞增殖、迁移和侵袭能力均受抑制，凋亡增加，且上皮-间质转化（EMT）相关标志物发生不利改变。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1后，这些功能损伤得到明显回复，说明RSA来源蜕膜巨噬细胞对滋养层细胞的不利作用，关键依赖于铁死亡激活。

**RSA-derived decidual macrophages regulate trophoblast ferroptosis via HMOX1**
在铁死亡相关差异基因中，HMOX1是变化最显著的候选分子。研究显示，与正常对照相比，RSA来源蜕膜巨噬细胞共培养可显著上调滋养层细胞HMOX1的mRNA和蛋白表达。进一步沉默HMOX1后，滋养层细胞内ROS、脂质过氧化、mitoSOX、Fe²⁺和MDA升高被逆转，GSH和GPx活性恢复，线粒体膜电位改善，ACSL4和TFR1下降，SLC7A11和GPX4回升。同时，滋养层细胞增殖、迁移和侵袭能力改善，凋亡减轻，BAX、Bcl-2、E-cadherin和Vimentin等标志物异常表达亦被纠正。该部分证明HMOX1是RSA来源蜕膜巨噬细胞促进滋养层细胞铁死亡和功能障碍的重要下游效应分子。

**RSA-derived decidual macrophages produce CXCL2 as a key regulator in the ferroptosis and other functions of trophoblast**
为寻找巨噬细胞向滋养层细胞传递信号的关键介质，研究人员分析了细胞因子-受体相互作用通路，发现CXCL2差异最为显著。CXCL2在蜕膜组织中的表达高于绒毛组织，且RSA患者蜕膜组织中CXCL2明显升高，提示其主要来自蜕膜侧。与此同时，滋养层细胞CXCR2表达在与RSA来源蜕膜巨噬细胞共培养后上升。进一步在原代巨噬细胞中沉默CXCL2后，滋养层细胞的铁死亡表型明显缓解，功能损伤同步改善，包括ROS和脂质过氧化下降、线粒体状态恢复、GSH与GPx活性增加、Fe²⁺和MDA下降，以及增殖、迁移、侵袭和抗凋亡能力恢复。由此可见，CXCL2是RSA来源蜕膜巨噬细胞驱动滋养层细胞铁死亡和功能障碍的关键分泌因子。

**The NF-κB signaling pathway mediates trophoblast ferroptosis induced by RSA-derived decidual macrophages**
在明确CXCL2后，研究进一步追踪其下游通路。转录组提示NF-κB通路显著富集。CHIP-qPCR和双荧光素酶实验表明，NF-κB核心亚基p65可直接结合HMOX1启动子并增强其转录活性；外源CXCL2或RSA来源蜕膜巨噬细胞共培养均可增强这一结合。RSA患者绒毛组织和共培养滋养层细胞中NF-κB信号均被激活。使用NF-κB抑制剂PDTC ammonium后，滋养层细胞的ROS、脂质过氧化、mitoSOX、Fe²⁺和MDA异常均被纠正，GSH和GPx活性恢复，线粒体膜电位改善，铁死亡相关蛋白表达逆转，且细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡表型均明显改善。进一步敲低p65可降低HMOX1表达，而在抑制NF-κB背景下过表达HMOX1又可恢复铁死亡和功能损伤表型；同样，沉默CXCL2可降低NF-κB激活及HMOX1表达，外源CXCL2诱导HMOX1上调依赖p65存在。该部分较为完整地确立了CXCL2/NF-κB/HMOX1信号轴。

**RSA decidual macrophages train trophoblasts to modulate M1/M2 macrophages**
该研究并未停留于单向调控，而是进一步揭示滋养层细胞对巨噬细胞的反向教育作用。先与HC或RSA来源蜕膜巨噬细胞共培养后的滋养层细胞，再与THP-1来源巨噬细胞或原代人蜕膜巨噬细胞共培养。结果显示，经RSA来源蜕膜巨噬细胞“训练”后的滋养层细胞可促进巨噬细胞向M1型极化，表现为CD86、TNF-α、CXCL9和iNOS上升，而CD206、CCL8、CD163和Arg-1下降。对滋养层细胞分泌因子的检测发现，IL-6变化最显著且在RSA条件下减少。ELISA证实其培养上清中IL-6下降，巨噬细胞中IL-6R表达也受到抑制。补充IL-6后，巨噬细胞M1极化受到抑制而M2极化增强。进一步发现，JAK2/STAT3通路磷酸化水平在该条件下被抑制，使用STAT3激动剂ML115后，巨噬细胞极化由M1向M2转变。由此说明，RSA来源蜕膜巨噬细胞不仅直接伤害滋养层细胞，还可通过降低滋养层细胞IL-6分泌，使其进一步推动巨噬细胞促炎极化，形成正反馈式炎症微环境。

**The CXCL2/NF-κB/HMOX1 signaling axis is critical for ferroptosis at the placental interface in aborted mouse**
体内研究进一步验证上述机制的生理相关性。流产小鼠胎盘界面中HMOX1、CXCL2和磷酸化p65表达均升高。沉默HMOX1可降低胚胎吸收率，减轻胎盘界面铁死亡和凋亡相关异常，并改善EMT相关标志物表达。沉默CXCL2同样降低胚胎吸收率，抑制铁死亡和凋亡，并下调HMOX1。应用NF-κB抑制剂PDTC ammonium后，也可取得类似保护效果，并逆转HMOX1升高。该部分表明，CXCL2/NF-κB/HMOX1轴不仅存在于体外共培养体系，也在流产小鼠胎盘界面发挥关键致病作用。

在药理学转化方面，研究人员基于中药数据库筛选和分子对接，确定圣草素（Eriodictyol）可能具有较高CXCL2结合亲和力。动物实验显示，Eriodictyol可显著降低流产小鼠胚胎吸收率，抑制胎盘界面CXCL2表达，改善铁死亡、凋亡和EMT相关异常。体外共培养实验进一步表明，Eriodictyol可阻断CXCL2-CXCR2结合及其下游信号激活，而过表达CXCL2或HMOX1，或激活NF-κB后，其保护作用被削弱；体内也观察到相似结果。因此，Eriodictyol的保护效应并非仅是非特异性抗氧化或抗炎作用，而与CXCL2/NF-κB/HMOX1轴密切相关。

讨论部分强调，本研究从母胎界面免疫微环境失衡出发，建立了“蜕膜巨噬细胞分泌CXCL2—激活滋养层细胞NF-κB—上调HMOX1—诱导滋养层细胞铁死亡与功能障碍”的机制链条，并进一步揭示受损滋养层细胞又可通过IL-6缺乏抑制JAK2/STAT3信号，促进巨噬细胞向促炎表型极化，形成双向放大的病理环路。这一发现不仅解释了RSA中免疫异常与滋养层损伤之间的内在联系，也为靶向铁死亡和免疫串扰提供了理论基础。研究同时指出，AAV和药物干预在体内并非仅作用于滋养层细胞，可能存在其他器官的脱靶影响，这是目前研究的重要局限。对于Eriodictyol与CXCL2的结合关系，作者也认为尚需进一步通过表面等离子共振等方法获得更严格证据。

研究结论部分可译为：总之，研究人员发现RSA患者蜕膜巨噬细胞能够诱导滋养层细胞发生铁死亡，提示靶向这一机制可能为重塑母胎耐受提供新的机会。本研究为RSA中母胎界面免疫微环境失调提供了新的认识，并为开发以调控蜕膜巨噬细胞介导的滋养层细胞铁死亡为核心的RSA临床干预策略提供了重要理论支持。