创新参选：平末端DNA片段加A方法的改进

时间：2010年9月10日

来源：生物通

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“赛默飞世尔特约之2010实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。目前活动已截止，评选结果将于9月15日公布。

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目前生物通已经公布了一些项目，这些项目也倍受读者的关注。为了感谢这些分享实验技巧的参选者，生物通将于2010年9月10日从在此之前投稿的参选者中抽出三名，送出世博会门票一张。目前活动已截止，评选结果将于9月15日公布。

中山大学的陈家杰对平末端DNA片段加A方法进行了改进。

背景：高保真PCR酶利用自身的3’→5’外切酶活性（pfu DNA Polymerase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase等）能保证PCR产物的保真度，但扩增的PCR产物为不带A尾的平末端DNA片段，不能直接TA克隆。因此，平末端DNA片段需要进行加A后方可TA克隆。平末端DNA加A的步骤一般是先纯化PCR产物，加入dATP Buffer利用Taq DNA polymerase在平末端片段后加上A尾后才能与T载体的T头互补连接TA克隆。步骤较为烦锁，要购买特定的dATP Buffer。

方法改进：平末端DNA片段加A方法根据实验者的技能程度推荐两种方法：（1）保守法，先对平末端PCR产物纯化后，浓度要求至少20ng/ ul（大概就好，跑胶图像条带清晰，明亮），取14.5 ul PCR产物，加入2 ul Taq Buffer，3ul dNTP，0.5 ul Taq酶，在72度反应10~20min, 后直接回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作容易，成功率高；（2）快速法，高保真酶PCR后的管子（体系为50ul）不用先纯化直接加入3ul dNTP 和0.5 ul Taq酶继续72度反应10~20min，此后直接回收或跑胶回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作步骤较少和方便，节省实验时间和实验经费。

结果：推荐的两种方法均能使平末端DNA片段加A尾，方便TA克隆。另外，使用dNTP 代替dATP，节省实验经费。