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“赛默飞世尔特约之2010实验室创新技术大奖”评选活动开展以来,生物通已经陆陆续续收到不少项目,这些项目中有的能减少实验步骤,有的能降低实验成本,还有一些改进了实验设备,让我们的实验过程更加轻松。目前活动已截止,评选结果将于9月15日公布。
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目前生物通已经公布了一些项目,这些项目也倍受读者的关注。为了感谢这些分享实验技巧的参选者,生物通将于2010年9月10日从在此之前投稿的参选者中抽出三名,送出世博会门票一张。目前活动已截止,评选结果将于9月15日公布。
中山大学的陈家杰对平末端DNA片段加A方法进行了改进。
背景:高保真PCR酶利用自身的3’→5’外切酶活性(pfu DNA Polymerase,PrimeSTAR HS DNA Polymerase等)能保证PCR产物的保真度,但扩增的PCR产物为不带A尾的平末端DNA片段,不能直接TA克隆。因此,平末端DNA片段需要进行加A后方可TA克隆。平末端DNA加A的步骤一般是先纯化PCR产物,加入dATP Buffer利用Taq DNA polymerase在平末端片段后加上A尾后才能与T载体的T头互补连接TA克隆。步骤较为烦锁,要购买特定的dATP Buffer。
方法改进:平末端DNA片段加A方法根据实验者的技能程度推荐两种方法:(1)保守法,先对平末端PCR产物纯化后,浓度要求至少20ng/ ul(大概就好,跑胶图像条带清晰,明亮),取14.5 ul PCR产物,加入2 ul Taq Buffer,3ul dNTP,0.5 ul Taq酶,在72度反应10~20min, 后直接回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆,此方法操作容易,成功率高;(2)快速法,高保真酶PCR后的管子(体系为50ul)不用先纯化直接加入3ul dNTP 和0.5 ul Taq酶继续72度反应10~20min,此后直接回收或跑胶回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆,此方法操作步骤较少和方便,节省实验时间和实验经费。
结果:推荐的两种方法均能使平末端DNA片段加A尾,方便TA克隆。另外,使用dNTP 代替dATP,节省实验经费。
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