综述：酸性氨基酸和天然二肽的心肌保护作用：一个未充分利用资源的潜力

本综述深入探讨了酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）及天然二肽在心肌缺血再灌注（IR）损伤保护中的潜力。文章系统回顾了临床前与临床证据，强调了通过膜转运体（EAAT1-3, PEPT2）提升心肌细胞内保护物质浓度的重要性，并揭示了其通过能量供应、抗氧化（如GSH系统）及调节钙稳态（如通过JAK2/STAT3通路）等多重机制发挥心脏保护作用，为心脏手术及心肌梗死治疗提供了新的策略视角。

引言：缺血再灌注损伤

心血管疾病是影响心脏和循环系统所有疾病的总称，其中冠状动脉疾病（CAD）最严重的后果是动脉粥样硬化斑块破裂导致冠状动脉血栓性闭塞，引发心肌损伤。及时再灌注对于挽救心肌至关重要，但再灌注本身会带来新的损伤，即缺血再灌注（IR）损伤。IR损伤的病理生理学主要涉及钙超载、活性氧（ROS）产生和线粒体功能障碍，其他因素还包括炎症、凋亡和自噬。在心脏手术中，主动脉交叉钳的夹闭（缺血）和移除（再灌注）过程也会遇到同样的问题。尽管外科技术取得了关键进展，但约有67%的体外循环（CPB）患者会出现术后并发症。因此，寻找最佳的心肌保护方法仍在继续。

心脏中的酸性氨基酸

二羧基氨基酸谷氨酸和天冬氨酸对蛋白质合成至关重要，谷氨酸还充当神经递质。它们在心肌细胞中浓度很高，例如，人心脏中谷氨酸和天冬氨酸的细胞内浓度分别为6.2 ± 0.5 μmol/g湿重和1.32 ± 0.12 μmol/g湿重，而在人血浆中的浓度则低得多，导致组织与血浆浓度比分别高达83和120。实验模型和人体研究均表明，在心脏受损期间，这些酸性氨基酸的浓度显著降低，且这种降低与丙氨酸浓度的增加相关，暗示了代谢应激。

谷氨酸和天冬氨酸在中间能量代谢中扮演重要角色。它们参与苹果酸-天冬氨酸穿梭，控制心肌细胞胞质和线粒体之间还原当量的分布。两者可通过转氨基作用（谷氨酸还可脱氢）形成三羧酸（TCA）循环中间体，即α-酮戊二酸和草酰乙酸，随后在循环后期通过底物水平磷酸化产生ATP。由于缺血时能量代谢严重受损，谷氨酸和天冬氨酸作为ATP潜在来源的能力使其与心肌保护联系起来。谷氨酸还可由谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶生成。有报道称，在缺血前和缺血后添加2.5 mM谷氨酰胺能改善大鼠心脏的恢复，但该保护作用与热休克蛋白70和O-连接β-N-乙酰葡糖胺表达增加相关，并未测量谷氨酰胺酶活性。然而，谷氨酰胺的稳定性存在疑问，这促使了含谷氨酰胺二肽的成功使用。

心脏中的天然二肽

天然二肽是由两个氨基酸通过肽键连接而成。例如，肌肽含有β-丙氨酸和组氨酸。肌肽在心脏中具有多种可能在IR期间有益的作用，包括淬灭活性羰基物种、解毒醛类、细胞内pH缓冲以及调节能量代谢。通过组学技术发现，在大鼠异丙肾上腺素诱导心肌梗死前，腹腔注射250 mg/kg/天的肌肽进行预处理，可减少组织病理学改变、丙二醛、二烯共轭物和蛋白质羰基水平，同时增加还原型谷胱甘肽（GSH）水平、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性。其他具有心脏保护作用的二肽包括甘氨酰-L-谷氨酰胺（gly-gln）和丙氨酰-L-谷氨酰胺（ala-gln）。

实验研究证据：酸性氨基酸

多项实验研究调查了在不同IR模型中补充酸性氨基酸的效果。使用的谷氨酸浓度最低为0.01 mM，最高为100 mM。在肥厚心脏中，伴随天冬氨酸细胞内浓度的增加，观察到了功能恢复的改善。谷氨酸和天冬氨酸通常以各13 mM的浓度联合使用。将分离的心肌细胞负载5.4 mM的K⁺-谷氨酸可增加ATP水平，并保护细胞免受缺氧和再灌注损伤。随后研究发现，负载谷氨酸的心肌细胞还能抵抗活性氧的产生，这引出了一个新假说，即谷氨酸代谢通过谷氨酸脱氢酶最终与谷胱甘肽过氧化物酶对过氧化氢的解毒作用相联系。

实验研究证据：天然二肽

关于天然二肽的实验研究较少，可根据所使用的二肽类型进行分类，包括肌肽、γ-glu-cys、含谷氨酰胺的二肽以及一项研究亮氨酸和酪氨酸不同组合的研究。对IR前30分钟腹腔注射150 mg/kg N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（ala-gln）的保护分子机制进行了研究。与未处理的IR组相比，ala-gln处理的IR组显示Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白表达增加，表明在ala-gln存在下，IR期间JAK2/STAT3通路的激活导致凋亡减少并促进细胞存活。这可能伴随着炎症增加和细胞因子（如IL-6和TNF-α）表达上调，且JAK/STAT通路可能与其他通路（如p38 MAPK）相互作用而变得复杂。

临床试验证据：单一和联合酸性氨基酸

谷氨酸在心肌保护中的作用已在两项随机对照临床试验（RCT）中进行研究：GLUTAMICS和GLUTAMICS II。在GLUTAMICS中，接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的患者在主动脉钳夹前输注盐水或125 mM谷氨酸，并在主动脉开放后继续输注2小时。唯一显著差异是，左心室心力衰竭患者如果接受了谷氨酸，其ICU停留时间和呼吸机使用时间更短。该队列在鱼精蛋白给药后乳酸水平也较低。最终，与对照组相比，谷氨酸治疗组术后严重心力衰竭发生率降低，但糖尿病患者除外。GLUTAMICS II同样招募了接受CABG的患者并输注/不输注125 mM谷氨酸，但患者为中度至高度风险，主要终点是NT-proBNP（心力衰竭的生物标志物）的释放。与对照组相比，谷氨酸输注组的急性肾损伤和NT-proBNP释放显著减少，但这仅发生在非糖尿病患者中。这支持了GLUTAMICS I的发现，并表明谷氨酸输注可能对非糖尿病患者心脏手术期间的心肌保护有作用。作者推测糖尿病患者与非糖尿病患者之间的差异可能与线粒体EAAT1表达差异有关。富含天冬氨酸的心脏停搏液也观察到了类似的关于再灌注损伤的有益效果。

早期研究表明，联合补充总计13 mM的天冬氨酸和谷氨酸，与对照组相比，术后第一小时心输出量显著改善。这些发现得到了一个相对近期研究的支持，该研究使用富含13 mM谷氨酸/天冬氨酸的Del Nido心脏停搏液，与未补充的对照组相比，心输出量和每搏功指数显著改善，并伴有肌钙蛋白I（TnI）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）释放显著减少以及血浆乳酸浓度降低。这表明，除了改善功能参数外，心脏停搏液富含天冬氨酸和谷氨酸可能减少膜损伤并改善代谢。

临床试验证据：天然二肽

ala-gln的治疗用途已在心脏手术环境中进行研究。例如，患者术前3天每天两次口服25 g ala-gln，手术当天早上再服用一次，与服用麦芽糊精的对照组相比。治疗组患者术后肌钙蛋白I、CK-MB和肌红蛋白水平较低，临床并发症减少。这引入了口服补充作为一种给药途径的可能性。

膜转运的重要性

过去关于酸性氨基酸心肌保护的研究结果存在矛盾，保护作用似乎取决于外源性酸性氨基酸的添加是否能提高其在心脏组织中的细胞内浓度。当浓度升高时，出现保护作用；当浓度未升高时，则无保护作用。当我们开发出一种将谷氨酸负载到分离心肌细胞的新方法，并随后观察到对氧化或缺氧应激的抵抗力增强时，进一步支持了提高细胞内浓度对于保护的必要性。然而，这种方法依赖于酶消化过程中膜通透性和钙浓度的变化，因此无法转化为开放心脏手术。任何氨基酸/二肽细胞内浓度的另一个关键决定因素是膜转运，这是在心脏中常被忽视的话题。是否因为对在心脏损伤期间最大化酸性氨基酸/二肽摄取的最佳条件了解不足，从而阻碍了其保护潜力的发挥？

酸性氨基酸转运

在分子鉴定和克隆负责转运的蛋白之前，传统上是在从肾脏或小肠分离的刷状缘膜囊泡（BBMV）中研究酸性氨基酸的摄取。这种方法很有吸引力，因为囊泡缺乏分解氨基酸所需的代谢机制，使得可以使用放射性示踪剂追踪转运。这导致酸性氨基酸转运体被分类为不同的转运系统。负责酸性氨基酸转运的系统被称为XAG_-。我们在首次全面表征心脏肌膜囊泡（CSV）和分离心肌细胞中天冬氨酸摄取特性时，也采用了传统的膜囊泡方法。我们发现天冬氨酸转运依赖于内向Na⁺和外向K⁺梯度，具有高亲和力饱和性、生电性，并且在时间过程中产生典型的超射现象。后者很重要，因为它使得酸性氨基酸能够逆其巨大的心肌与血浆浓度梯度进行摄取。这与Dinkelborg等人发现CSV中谷氨酸摄取也依赖于内向H⁺梯度的结果一致，均符合XAG_-系统。一项有趣的研究使用分离的心肌细胞发现，缺氧刺激了谷氨酸的摄取。

一个关键的时刻发生在1990年代初，几乎同时鉴定出三个不同的基因编码的转运体，当在不同细胞类型中表达时，显示出与XAG_-系统一致的酸性氨基酸摄取。它们的人类同源物被鉴定为溶质载体1家族，包括EAAT1（SLC1A3）、EAAT2（SLC1A2）、EAAT3（SLC1A1）、EAAT4（SLC1A6）和EAAT5（SLC1A7）。其中，仅在心脏中检测到EAAT1-EAAT3蛋白，尽管EAAT5的mRNA也可能存在。

在肥厚心脏中，EAAT2和EAAT3的表达增加，伴随着转运速率的增加。这与离体灌注心脏补充0.5 mM天冬氨酸或谷氨酸时组织浓度增加相关，并导致IR后恢复改善。此后，有人提出谷氨酸的保护作用可能与EAAT1-3和心脏肌膜钠钙交换体（NCX-1）之间的功能相互作用有关。在表达NCX-1的成肌细胞中，添加谷氨酸改善了细胞存活率和线粒体功能，并使反向模式NCX-1活性正常化。这些效应在野生型成肌细胞以及存在NCX-1抑制剂（SN-6）或EAAT抑制剂（DL-TBOA）时被逆转。由于过多的钙内流是有害的，因此认为在持续提供谷氨酸的情况下，NCX-1活性的增加仅达到一个新的更高稳态水平。

在经历冠状动脉结扎和释放（IR）的大鼠中，加巴喷丁的使用阻止了谷氨酸分泌。相反，EAAT抑制剂二氢海人藻酸（DKA）没有效果，表明心脏谷氨酸分泌不是通过EAAT转运体介导的。DKA的存在增加了室性心律失常的发生，并伴有肌浆网钙ATP酶活性降低和SERCA-2蛋白表达减少。与Maiolino等人的结果一起，这表明谷氨酸摄取在IR期间维持心脏钙稳态中起作用。

在另一项研究中，Martinov等人证实了大鼠心脏中存在EAAT1和EAAT3蛋白；然而，当他们使用谷氨酸转运抑制剂LL-BOA时，未观察到IR后功能参数的改善。未测量室性心律失常和钙稳态。这些实验与其他使用谷氨酸转运抑制剂实验的另一个区别是没有添加外源性谷氨酸。这也与证据一致，即当在存在心外谷氨酸的情况下，酸性氨基酸的细胞内浓度增加时，会发生心肌保护。

天然二肽转运

心脏中的二肽转运首次在新鲜分离的豚鼠心肌细胞中得到表征。关键特性包括依赖于内向H⁺梯度、饱和性（K_m为0.496 mM，V_max为1470.5 ± 69.6 pmol/μL/min）、被多种二肽和拟肽药物抑制但不被组成单氨基酸抑制。这与肾脏细胞系SKPT和大鼠肾脏BBMV中报道的转运特性一致。与这些转运特性一致的是PEPT2的表达。该转运体是质子偶联寡肽转运家族的一员，其中只有PEPT2在心脏中表达。在进一步的一系列实验中，研究了衰老和高血压过程中PEPT2转运体的表达和活性。在正常Wistar大鼠心脏的CSV中，随着年龄增长，二肽摄取的最大速率在中年时显著增加，然后在老年时降低。这伴随着中年大鼠CSV中PEPT2蛋白表达更高，以及中年心脏中SLC15A2表达更高。这对中年治疗性拟肽药物的使用具有意义。这也可能很重要，因为我们已证明中年心脏对IR更敏感，并受到gly-gln的保护，以及肥厚心脏对IR的脆弱性增加。在肥厚心脏（SHR）中，二肽摄取的最大速率显著低于Wistar和WKY大鼠。这与显著较低的PEPT2蛋白表达但显著较高的SLC15A2表达相关。这可能反映了这些心脏中的翻译后修饰，并且与高血压中使用ACE抑制剂也相关。

局限性与未解问题

所述工作存在局限性，表明在考虑临床转化之前需要进行更多研究。表1、2、3和4中报告的研究在使用的浓度和酸性氨基酸/二肽添加时机方面各不相同。在GLUTAMICS II中，NT-proBNP和急性肾损伤仅在非糖尿病患者中降低，而在我们的研究中，只有肥厚心脏显示出恢复改善和EAAT表达增加。这表明保护作用可能因患者群体而异。心脏手术患者通常服用多种不同药物。这些药物与酸性氨基酸/天然二肽之间可能的相互作用尚未研究。也不知道药物如何与EAATs/PEPT2相互作用。还应考虑实施涉及酸性氨基酸/天然二肽策略的成本，尽管这些化合物可通过商业来源 readily available。有必要解决这些重要问题。

未来研究方向

需要澄清特定酸性氨基酸转运体在心肌保护中的作用。这可以通过使用基因敲除小鼠来实现。假设酸性氨基酸的分泌和摄取是通过不同途径介导的，需要进行更多且可重复的研究，在抑制酸性氨基酸分泌的同时提供外源性酸性氨基酸的效果。还需要在使用的浓度和使用的停搏液类型（即晶体液与含氨基酸血液）方面提高一致性。关于天然二肽，如哪种含谷氨酰胺二肽最有效，也需要更多工作。

结论

对膜转运机制和可能保护手段理解的改进，增加了关于如何利用酸性氨基酸和二肽保护心脏免受IR损伤的知识。关于将转运与保护相结合，目标是优化条件以在IR期间最大化摄取并防止分泌，从而使保护效应得以实现。一旦实现这一点，有必要进行更大规模的临床试验。