引言
靶向蛋白降解（TPD）技术通过劫持细胞内泛素-蛋白酶体系统诱导蛋白降解，在靶向"不可成药"蛋白和克服耐药性方面展现出独特优势。分子胶降解剂（MGDs）作为单价小分子，可避免PROTACs常见的钩状效应等局限性。目前MGDs的理性发现仍面临挑战，本研究开发了SPR-DI新方法，将表面等离子体共振（SPR）的高通量无标记筛选与降解组学-相互作用组学双验证相结合。
SPR-DI方法的建立与验证
研究团队构建了包含SPR初筛、双组学验证和功能确认的完整流程。以已知MGD分子VH032为模型，证实其与VHL的结合亲和力Kd值为0.47 μM。通过降解组学分析发现CDO1蛋白显著下调，同时相互作用组学检测到VHL-CDO1复合物形成，双重验证了该方法对MGDs底物蛋白的识别能力。
基于E3连接酶的天然产物MGDs筛选
选择VHL和Keap1作为模型E3连接酶，对393种含α,β-不饱和羰基的天然产物库进行SPR筛选。发现雷公藤甲素（TP）与VHL结合最强（Kd=0.15 μM），鬼臼毒素（PPP）与Keap1亲和力最高（Kd=0.77 μM）。通过微量热泳动（MST）技术正交验证了结合特异性。
底物蛋白的系统性鉴定
在HEK293T细胞中，通过细胞活性实验确定化合物非毒性浓度后，进行24小时降解组学分析和6小时相互作用组学检测。TP处理组中，IMP3和BRIX1蛋白在双组学数据中共同富集；PPP处理组中，DDX52和LDHB被同时鉴定为候选底物。双组学交叉验证显著提高了底物识别的准确性。
TP和PPP降解机制的验证
深入机制研究表明，TP可诱导VHL介导的IMP3剂量依赖性降解，DC50为1.87 μM，且依赖泛素-蛋白酶体系统。在VHL基因敲除细胞中，TP的降解效应完全消失。类似地，PPP通过Keap1促进DDX52（DC50=0.27 μM）和LDHB（DC50=0.23 μM）的泛素化降解，且未观察到钩状效应。
三元复合物形成机制解析
TR-FRET和MST实验证实，TP可促进VHL-IMP3复合物形成（EC50=7.19-10.59 μM），PPP增强Keap1与DDX52/LDHB的相互作用。分子动力学模拟显示，PPP同时与Keap1和底物蛋白形成氢键网络，而TP可能通过诱导VHL构象变化发挥作用。Co-IP实验直接验证了化合物依赖的三元复合物组装。
MGD效应与独立药理作用的辨析
通过比较野生型与E3敲除细胞的蛋白质组学差异，发现TP引起的差异表达蛋白中75.3%属于VHL依赖性MGD效应，主要富集在核糖体生物合成通路。PPP处理组中78.3%的蛋白变化依赖Keap1，其MGD效应与IGF-1R抑制活性在相似浓度下共同调控能量代谢通路。
结论与展望
SPR-DI策略成功实现了天然来源MGDs的高效发现，揭示了TP和PPP通过新型分子胶机制调控蛋白质降解的功能。该方法将SPR筛选与双组学验证有机结合，为拓展E3连接酶工具箱、开发靶向难治性疾病的降解剂提供了新范式。未来通过优化相互作用捕获技术和扩展细胞模型体系，有望加速MGDs从偶然发现向理性设计的转变。
