中医作为中华民族的宝贵遗产，经过数千年的临床实践，形成了独特的理论体系，并在疾病预防和治疗方面赢得了声誉，对人类健康做出了重大贡献[1]、[2]、[3]。然而，中药制剂具有复杂的化学成分，其中既包含治疗活性成分，也包含可能引起不良反应的潜在有毒物质[4]。近年来，随着中药注射剂、专利中药和健康补充剂的广泛使用，包括肝损伤[5]、肾损伤[6]和心脏损伤[7]在内的不良反应报告显著增加。其中，线粒体毒性已成为一个不可忽视的关键机制。多项研究表明，雷公藤内酯[8]、某些乌头碱[9]、大黄和Polygonum multiflorum中的蒽醌类化合物以及黄樟素等物质可以通过直接或间接途径破坏线粒体膜完整性，抑制呼吸链复合体的活性，并诱导线粒体通透性转运孔的开放。这些破坏最终导致能量代谢紊乱和氧化应激。这种毒性通常具有隐蔽和延迟的特点，使得通过传统的动物实验和病理检查难以早期发现。现有的化学分析方法在有效捕捉生物功能层面的变化方面也存在不足。因此，建立一个基于分子机制的、灵敏可靠的中药诱导线粒体毒性监测系统不仅对于进行科学和客观的安全性评估至关重要，也是确保临床用药安全的关键步骤。此外，这对于推进科学监管和中药的精准应用也具有重要意义。
细胞色素c氧化酶（CcO）的异常活性是线粒体毒性的关键事件，其后果远不止于能量代谢的紊乱。作为线粒体电子传递链的末端酶，CcO催化氧气还原为水，同时驱动质子泵送以维持膜电位，是氧化磷酸化的核心调控点[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。当CcO活性受到抑制时，首先会导致质子梯度崩溃和ATP合成急剧减少，引发细胞能量危机。更严重的是，电子传递链的破坏会导致大量上游电子泄漏，促进活性氧（ROS）的爆发性生成。过量的ROS不仅会攻击线粒体脂质、蛋白质和DNA，进一步恶化线粒体功能，还会激活依赖线粒体的凋亡途径：膜电位的崩溃会促使细胞色素c释放，与Apaf-1和caspase-9结合形成凋亡小体，不可逆地启动程序性细胞死亡[15]。这种级联反应会显著放大即使是微弱的CcO抑制作用，最终导致肝细胞、肾小管上皮细胞和心肌细胞等重要功能细胞的广泛凋亡或坏死[16]，从而引发多器官毒性。因此，实时、精确地监测CcO活性的变化不仅能够早期识别与中药成分相关的线粒体毒性风险，也为理解其毒理机制和预测器官损伤风险提供了重要窗口。
传统的CcO活性检测方法主要包括分光光度法[17]和组织化学染色[18]。分光光度法依赖于CcO催化的细胞色素c氧化过程中的吸光度变化，操作简单，但灵敏度较低且容易受到样品基质的干扰。组织化学染色可以直观地进行原位组织检测，但由于染色条件的差异性较大，操作繁琐。相比之下，电化学生物传感器因其高灵敏度、快速响应、低成本和易于微型化而成为检测酶活性的理想选择[19]、[20]、[21]。然而，传统的电极材料（如玻璃碳电极、金电极）在电子转移效率、生物相容性和稳定性方面仍存在局限性，这凸显了开发新型纳米复合材料以提高传感器性能的必要性。
近年来，纳米材料在电化学生物传感器中的应用成为了一个重要的研究方向，为高灵敏度酶活性检测提供了新的策略。纳米材料具有出色的化学、物理和电催化性能，以及独特的量子尺寸和表面效应，有望显著提升传感器性能。其中，基于碳的电极和碳纳米材料改性的电极在电化学分析中得到了广泛的研究和应用[22]。石墨烯（Gr）是一种由单层碳原子通过sp2杂化键连接而成的二维蜂窝状晶格材料[23]。由于其优异的导电性、大的比表面积和高生物相容性，石墨烯被广泛用于构建酶生物传感器。例如，Vicente等人[24]开发了一种基于石墨烯的非侵入式血糖检测传感器，具有阿托摩尔级别的灵敏度。然而，原始石墨烯容易因π-π堆叠而聚集，从而降低其活性表面积。碳纳米纤维（CNFs）[25]具有较高的机械强度，能促进电子快速转移，从而提高电极的稳定性和响应速度。Lu等人[26]开发了一种基于石墨烯-纤维素纳米纤维（Gr-CNF）复合膜的双模式应变/湿度传感器，并成功应用于慢性呼吸疾病的非侵入性诊断。然而，CNFs的表面官能团有限，导致生物分子亲和力低，酶固定效率不高。壳聚糖（CS）[27]是一种天然多糖，具有优异的成膜能力、生物相容性和易于化学修饰的特性，能够有效固定纳米材料并提高传感器稳定性。此外，我们在纳米复合材料（CS@CNF/Gr）的表面沉积了金纳米粒子（AuNPs）[28]，这不仅提高了电子导电性，还实现了表面功能化，从而提高了酶的固定效率。Yu等人[29]使用氮掺杂石墨烯和AuNPs构建了一种传感器，在过氧化氢检测中表现出更好的性能。为了实现高灵敏度和稳定性的电化学传感，本研究旨在基于金纳米粒子、壳聚糖、碳纳米纤维和石墨烯构建一种协同增效的纳米复合材料（AuNPs/CS@CNF/Gr）。在这种设计中，石墨烯作为高导电基底，碳纳米纤维作为三维间隔层，有效防止石墨烯片层堆叠并增加比表面积；壳聚糖作为分散剂和生物相容性基质，改善了材料的成膜性能和生物分子固定能力。金纳米粒子进一步修饰在该三维网络上，提高了电子传输效率并提供了优异的生物相容性界面。通过在电极表面合成这种纳米复合材料，制备出了高性能的细胞色素c氧化酶（CcO）生物传感器，从而实现了对酶活性的高灵敏度检测。
基于此，本研究使用了壳聚糖改性的石墨烯和碳纳米纤维复合材料作为电极修饰剂，然后沉积金纳米粒子（AuNPs）。利用AuNPs优异的生物相容性和易于功能化的特点，将CcO牢固地固定在电极表面（CcO/AuNPs/CS@CNF/Gr/GCE）。固定的CcO催化其底物细胞色素c从还原态（Fe2+）氧化为氧化态（Fe3+）。通过检测细胞色素c的氧化还原电流来量化CcO活性，该方法实现了对酶活性的高灵敏度和选择性实时监测。该传感器充分利用了纳米复合材料的协同优势：石墨烯和碳纳米纤维提供了高效的电子传输路径，金纳米粒子增强了生物分子的固定效果，壳聚糖基质有助于维持稳定的酶活性。这种集成方法最终建立了一个响应迅速、检测限低且抗干扰能力强的分析平台（图1）。这项研究不仅为中药诱导的线粒体毒性的实时和准确分析奠定了坚实的技术基础，也为改进安全评估系统和确保患者用药安全提供了实际的技术支持。
