一种结构优化的BRET生物传感器，用于快速、无需稀释地定量废水中的高浓度硝酸盐

时间：2026年1月24日

来源：Biosensors and Bioelectronics

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本研究开发了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的硝酸盐传感器，通过整合大肠杆菌硝酸盐受体NarX与高亮度NLuc/VenusΔC10报告对，结合计算指导的突变（NarXV138W）和结构指导的截断优化，实现了无需稀释的高浓度硝酸盐检测（0.0781-2.5710 g/L），R²=0.999，ΔBRET=0.28，适用于工业废水原位监测。

赵康琳|白浩|沙子琪|胡新鹏|张燕|张旭翔

中国江苏省南京市南京大学环境学院，国家水污染控制与绿色资源循环利用重点实验室，邮编210023

摘要

本研究开发了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的生物传感器，用于快速、无需稀释地定量检测废水中的高浓度硝酸盐。该传感器将大肠杆菌（Escherichia coli）的硝酸盐受体NarX与高亮度的NLuc/VenusΔC10报告对结合，并通过计算引导的突变（NarXV138W）、基于结构的末端截短以及检测参数调整进行了优化。优化后的构建体VenusΔC12–N5NarXV138WΔC3–ΔN4NLuc能够在0.0781至2.5710 g/L的硝酸盐浓度范围内实现准确定量（R² = 0.999），且在约500秒的平衡时间后ΔBRET值为0.28。测量在温和的水性条件下进行，在模拟和真实水样中与紫外-可见光谱法的结果高度一致，从而无需大量稀释。圆二色性和质谱分析揭示了硝酸盐依赖性的结构变化，这些变化支持了配体诱导的信号传导机制。据我们所知，这是首个针对工业级硝酸盐检测设计的BRET生物传感平台，提供了一种简单、比率计量且试剂高效的方法，适用于工业和市政废水的原位监测。

引言

硝酸盐是水环境中最为普遍的污染物之一。除了农业和城市径流（Garcia-Segura等人，2018年；Yang和Toor，2017年）外，制药、光伏制造、化肥和弹药生产、畜牧业以及核能等行业也会产生大量富含硝酸盐的废水（Cyplik等人，2013年；Krishna Mohan等人，2016年）。从1970年到2010年，因硝酸盐污染而面临急性健康风险的人口从600万增加到6000万（Wang等人，2023年）。过量的硝酸盐负荷会加速富营养化、刺激有害藻类繁殖，并耗尽水生生态系统中的溶解氧（Kaown等人，2023年；Liu等人，2024b年）。在人类中，硝酸盐与婴儿的高铁血红蛋白血症、多种癌症、生殖障碍和甲状腺功能障碍有关（Jonvik等人，2016年；Uddin等人，2021年；Ward等人，2018年）。因此，可靠地定量检测硝酸盐，尤其是在高浓度废水中，对于有效的污染控制、工艺优化以及保护生态和人类健康至关重要。

传统的分析方法，包括紫外-可见光谱法、气相分子吸收光谱法和离子色谱法，虽然精度较高，但需要繁琐的样品制备、大量的试剂，并会产生二次化学废物（Cheong等人，2024年；Kalimuthu等人，2021年；Liu等人，2024a年；Silva等人，2024年）。这些技术也不适合直接测量高浓度硝酸盐，因为存在信号饱和和基质干扰的问题。生物传感器由于其简单性、低成本和低试剂消耗量而成为一种有前景的替代方案。电化学硝酸盐还原酶传感器在痕量水平下表现出高灵敏度，但在温度和pH值波动的情况下稳定性较差，限制了其在复杂废水基质中的应用（Coelho和Romao，2015年；Kalimuthu等人，2021年；Vrablova等人，2021年）。全细胞光学生物传感器能够实现高通量分析，但在长期稳定性和生物安全性方面面临挑战（Machado等人，2021年）。荧光强度传感器虽然应用广泛，但容易发生光漂白和环境干扰，而荧光共振能量转移（FRET）系统虽然提高了比率计量的精度，但依赖于外部激发，导致背景噪声较高，限制了其在高硝酸盐检测中的适用性（Verma等人，2023年；Yu等人，2023年）。

为了克服基于荧光和FRET的传感策略的局限性，生物发光共振能量转移（BRET）作为一种有吸引力的比率计量生物传感器设计方法应运而生（Dacres等人，2010年；Wu和Jiang，2022年）。BRET是一种依赖距离的过程，当两种发色团处于Förster距离范围内时，非辐射能量从生物发光供体（通常是荧光素酶）传递给光谱匹配的荧光受体（Weihs等人，2020a）。由于BRET依赖于内部光源，因此无需外部激发，从而避免了激发引起的背景荧光、光漂白和光散射等干扰，这些现象常见于基于荧光的测量中（Khamlichi等人，2019年）。这些特性使得BRET在光学和化学性质复杂的基质（如废水）中进行定量分析时具有明显优势，因为在这些基质中，浊度、高离子强度和有机物常常会干扰荧光或吸光检测。此外，BRET的比率计量特性能够自动校正传感器浓度和信号强度的变化，从而提高分析的稳健性。

尽管具有这些优势，BRET测量仍存在一些公认的局限性，包括供体发射信号渗透到受体通道中以及供体和受体发射光谱部分重叠，这可能导致与分析物诱导的构象变化无关的信号变化（Hiroyuki Kobayashi，2019年）。因此，选择具有良好光谱分离的供体-受体对，并配备适当的对照构建体，对于可靠的BRET传感至关重要（Tong Bu，2025年）。在现有的供体-受体系统中，NanoLuc（NLuc）/Venus对具有出色的亮度和稳定性，其Förster距离为2.80–8.39 nm，BRET效率超过80%（Suzuki等人，2016年；Weihs等人，2020b），非常适合在复杂的水环境中进行比率计量传感。

已有多种硝酸盐结合蛋白被鉴定为潜在的构象变化触发因子，包括McpN（Martin-Mora等人，2019年）、NasR（Chen等人，2022年）、NarX（Cheung和Hendrickson，2009年）、NarQ（Gushchin等人，2017年）、NrtA（Fatima等人，2020年）和NreA（Niemann等人，2014年）。结构研究表明，硝酸盐结合可以触发特定传感器结构域中的活塞式或剪刀式运动，为通过距离或方向依赖的能量转移将配体识别转化为光学信号提供了机制基础（Gushchin I等人，2020年）。合理的蛋白质工程策略，包括定点突变和系统截短，进一步提高了基因编码的FRET和BRET生物传感器的信号幅度、动态范围和灵敏度（Zhao等人，2016年）。

在这里，我们报道了一种基于结构优化的BRET生物传感器，能够直接、无需稀释地定量检测废水中的高浓度硝酸盐。通过将大肠杆菌的硝酸盐受体NarX与NLuc/VenusΔC报告对结合，并通过结构引导的突变和系统截短来优化其性能，该传感器在工业相关的硝酸盐浓度范围内可靠地工作。这一平台能够在温和的水性条件下实现快速、比率计量的硝酸盐检测，并在模拟和真实水样中表现出一致的性能。据我们所知，这是首个在高浓度硝酸盐环境下工作的基于BRET的生物传感器的实例。除了硝酸盐检测外，本文提出的蛋白质工程策略还为开发针对其他环境分析物的BRET生物传感器提供了一个实用且可推广的框架。

部分摘录

质粒构建

pET-VenusΔC10-Nluc载体编码了由(GGT-GGS)氨基酸接头连接的VenusΔC10-linker-Nluc融合蛋白，该载体已在我们的实验室中构建（Jie等人，2024年；Yu等人，2023年）。来自六种硝酸盐结合蛋白的传感器结构域，即NarX（PDB 3EZI）、NrtA（PDB 2G29）、NarQ（PDB 5IJI）、NasR（PDB 4AKK）、McpN（PDB 6GCV）和NreA（PDB 4IUK）（图S1和表S1），分别被克隆到pET-VenusΔC10-Nluc的GGT和GGS接头之间的多克隆位点上

BRET生物传感器的设计与构建

BRET传感器设计中的一个关键考虑因素是将合适的生物识别元件与高性能的供体-受体对配对。评估了六种硝酸盐结合蛋白作为识别元件：来自Synechocystis sp. PCC 6803的NrtA、来自Klebsiella oxytoca的NasR、来自Staphylococci的NreA、来自Escherichia coli的NarX和NarQ以及来自Pseudomonas aeruginosa PAO1的McpN。先前的研究表明，NrtA和NasR可以用作FRET生物传感器中的识别模块（Chen等人

结论

本研究建立了一种快速、无需稀释的BRET生物传感平台，用于准确定量废水中的高浓度硝酸盐。通过将大肠杆菌（E. coli）的硝酸盐受体NarX与高亮度且稳定的NLuc/VenusΔC10对结合，并通过计算引导的突变（NarXV138W）和基于结构的多位点截短来优化其性能，优化后的生物传感器蛋白能够在工业相关的硝酸盐浓度范围内实现稳健的比率计量检测

CRediT作者贡献声明

胡新鹏：可视化、软件、方法学、实验研究。沙子琪：可视化、验证、方法学。张旭翔：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。张燕：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、方法学、实验研究、资金获取、概念构思。白浩：撰写 – 初稿撰写、可视化、验证、软件开发、方法学、实验研究、数据管理。赵康琳：撰写 – 初稿撰写