蛋白质是生命的执行者，其合成过程——翻译，是细胞中最精细、最耗能的过程之一。然而，即使是这台高度优化的分子机器，也会遇到“路障”。其中，最令人头疼的挑战之一来自于一种名为脯氨酸的氨基酸。脯氨酸在生物学中是一个悖论：它对于蛋白质的结构和功能至关重要，却在翻译过程中制造了巨大的麻烦。其独特的环状结构赋予了其刚性和受限的骨架角度，这使得肽键的形成异常缓慢，尤其是在连续多个脯氨酸（如Pro-Pro或Pro-Pro-Pro）出现的序列处，核糖体极易陷入停滞。这种“脯氨酸困境”在所有生命领域中都存在，但细菌面临着巨大的进化压力，必须克服脯氨酸诱导的核糖体停滞，以确保生存。因此，它们进化出了一套复杂的专门翻译因子系统。
为了深入探究细菌如何解决这一难题，研究人员开展了一项系统性研究，相关成果发表在《Nucleic Acids Research》上。该研究旨在阐明是什么让脯氨酸在蛋白原性氨基酸中如此独特，并详细描述了细菌为应对其翻译挑战而演化出的多种策略。研究重点关注延伸因子P（EF-P）及其新发现的旁系同源物EfpL，以及ABC-F ATP酶（如Uup、YbiT）和YebC/TACO1蛋白家族。通过整合生物化学、结构生物学和比较基因组学的方法，研究揭示了这些因子如何通过不同的分子机制识别停滞的核糖体，稳定肽酰转移酶中心（PTC）的几何结构，从而促进困难序列（尤其是富含脯氨酸的基序）的肽键形成。研究表明，这些救援系统并非冗余，而是构成了一个多层次的安全网，共同确保蛋白质合成的效率和保真度。它们的分布和活性与细菌的生长速率和代谢状态密切相关，甚至可被用于基因表达的精细调控。
研究人员综合利用了多种关键技术方法来揭示这些翻译救援因子的功能和机制。这包括冷冻电镜（Cryo-EM）技术，用于解析EF-P等因子与核糖体复合物的高分辨率结构，从而直观展示其作用位点和构象；核糖体分析（Ribosome Profiling），用于在全基因组范围内精确绘制翻译过程中的核糖体停滞位点，识别出依赖于EF-P等因子的特定氨基酸基序；以及基于大规模基因组数据库（如GTDB）的比较基因组学分析，用于追踪EF-P、ABC-F蛋白和YebC家族在不同细菌类群中的分布、进化关系及其与细菌生长速率等表型的关联。对于涉及修饰的因子（如EF-P的β-赖氨酸化），则结合了质谱分析以鉴定其具体的翻译后修饰（PTM）类型和位点。
EF-P及其旁系同源物EfpL的结构与机制
EF-P是细菌解决脯氨酸停滞问题的主要方案。其结构呈L形，由三个结构域组成，模仿了tRNA的大小和形状。
当核糖体在脯氨酸基序处停滞时，EF-P会结合到核糖体的E位点，其修饰后的关键赖氨酸残基（在大肠杆菌中为Lys34）会靠近P位点tRNA的3‘-CCA末端，形成稳定接触，将tRNA推入正确位置，为肽键形成创造有利的几何构象。研究提出了一个“扫描-结合”模型：EF-P快速、非特异性地结合具有空E位点的核糖体，但只有当P位点tRNA是能从EF-P作用中受益的类型（如tRNA
Pro）时，才会稳定结合。
跨物种的EF-P翻译后修饰
一个反复出现的主题是，EF-P/aIF-5A的活性需要翻译后修饰。不同生物采用了化学上截然不同的修饰策略来激活其EF-P。
例如，大肠杆菌等许多变形菌门的EF-P在Lys34处被β-赖氨酸化；而铜绿假单胞菌等细菌则对EF-P环尖端的精氨酸进行鼠李糖基化；枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌采用5-氨基戊醇进行修饰。值得注意的是，并非所有EF-P都需要修饰，例如放线菌门中的EF-P通过其环侧翼的两个脯氨酸残基来刚性化环结构，从而“内置”了活性。
缓解核糖体停滞的替代翻译因子
除了EF-P，ABC-F ATP酶（如Uup, YbiT, YheS, EttA）是另一类重要的翻译救援因子。它们共享一个核心结构，包含两个ABC ATP结合域和一个独特的P位点tRNA相互作用基序（PtIM）。
它们以ATP结合状态结合到核糖体E位点，其PtIM朝向PTC。ATP水解可能诱导构象变化，促进肽键形成并使因子从核糖体上解离。研究表明，这些ABC-F旁系同源物并非冗余，而是有分工地缓解不同类型的停滞：YheS解决SecM肽引起的停滞；YbiT拯救多聚碱性或酸性残基处的停滞；EttA防止延伸早期（尤其是带负电荷基序）的固有核糖体去稳定化（IRD）；而Uup则专门缓解脯氨酸包含基序处的停滞。
YebC/TACO1家族及在细菌和线粒体中的翻译停滞解决
YebC/TACO1家族代表了另一种进化上独立的解决方案。该家族蛋白结构与ABC-F ATP酶或EF-P截然不同，由三个结构域串联而成，其结构域I和II带有正电荷表面斑块，负责与RNA结合。研究发现，例如在枯草芽孢杆菌中，YebC_II（而非YebC_I）可以拯救缺失EF-P和YfmR（一种ABC-F蛋白）的双突变体的生长。其作用模式是通过直接结合核糖体（23S rRNA），可能通过静电相互作用稳定核糖体-新生链复合物，而不是催化任何反应。在线粒体中，其同源物TACO1（COX1翻译因子）被证明可通过防止线粒体核糖体在编码细胞色素c氧化酶亚基COX1和COX3的多脯氨酸片段处停滞，对于线粒体蛋白合成至关重要。
核糖体救援系统对细菌蛋白质组动态的进化影响
脯氨酸困境如何塑造基因组？研究表明，生物体感受脯氨酸挑战的程度与其最大生长速率密切相关。快速生长的细菌在其基因组中编码的脯氨酸基序显著少于慢速生长的细菌。对5000多个高质量细菌基因组的分析表明，编码至少一种脯氨酸聚焦的核糖体救援因子几乎是普遍的。EF-P和YebC分布广泛，而Uup的存在则更具限制性和谱系特异性。系统发育学独立方法显示，编码的救援因子数量与预测的倍增时间呈负相关，即物种预测生长越快，其倾向于编码越多的脯氨酸救援因子。这表明这些系统有助于在快速生长条件下优化翻译。
综上所述，脯氨酸同时是蛋白质结构的基石和翻译机器的弱点。细菌部署了一个多层次的安全网——EF-P/EfpL、专门的ABC-F ATP酶和YebC/TACO1家族——来绕过脯氨酸施加的动力学瓶颈，同时利用脯氨酸诱导的暂停作为调控特征。这些因子几乎普遍存在，其拷贝数与最大生长速率成正比，凸显了进化对不受干扰的延伸过程的高度重视。除了保护核糖体通量，脯氨酸救援系统还塑造了蛋白质组的组成，使生物体能够在活性位点、调控停滞肽和柔性连接子中编码多脯氨酸基序，而无需承担过高的适应性成本。研究结论强调了理解这些基本过程对于揭示生命调控奥秘及其在合成生物学和抗生素开发中的潜在应用具有重要意义。
