冷冻电子显微镜（cryo-EM）通过将样品保存在玻璃化（vitrified）状态，克服了传统透射电子显微镜（TEM）在观测软物质和功能性材料时的诸多局限。这项技术的关键优势在于其能有效缓解电子束辐射对样品的破坏效应，并降低成像所需的剂量，这对于研究电池材料界面、超导材料以及各类软物质（如聚合物、凝胶、胶体）的微观结构至关重要。
2. 冷冻电镜样品制备的进展：从载网到薄片
制备用于 cryo-EM 的样品需要精湛的技术和精确的步骤。样品制备主要包括两个部分：载网制备和样品优化。载网制备指的是使样品适用于在低温条件下进行显微镜分析的程序，包括载网的化学或等离子体处理、样品沉积和玻璃化。样品优化则涉及对样品进行定制，以获得电子透明的、结构保存完好的区域，可能包括使用聚焦离子束（FIB）铣削制备薄片。
2.1. 用于优化成像的电镜载网设计与选择
通常使用 3 毫米直径的圆形载网来制备 TEM 样品。在 cryo-EM 中，载网基底最常用铜（Cu）、金（Au）或钼（Mo）制成。载网支持膜的选择不仅限于上述组合，可以根据每个样品的具体特性和分析需求进行选择，这些需求可能包括化学抗性和惰性、背景 X 射线、机械和热稳定性以及改善的颗粒分布以实现更好的可视化。
2.2. 束敏感软物质的对比度增强技术
对于软物质和生物标本，TEM 图像对比度本质上是低的，因为这些材料几乎完全由具有非常小弹性散射因子的轻元素（H, C, N, O）组成。因此，冷冻透射电镜依赖于通过故意欠焦产生的相位衬度。目前，软物质样品主要通过干燥、正染或负染和/或冷冻固定进行研究。然而，冷冻固定下的冷冻电镜尽管其固有的低对比度和依赖相位衬度，却能够以冷冻水合状态无与伦比地可视化样品，是实现高分辨率成像的首要方法。
2.3. 玻璃化：通过快速冷冻保存天然状态
冷冻固定是生物样品（如蛋白质水溶液）的最佳保存方法。通常，将几微升（3–4 μL）的样品滴加到亲水化处理的载网上并进行吸滤（blotting）。最后，将样品投入液态乙烷或乙烷/丙烷中快速冷冻。这种快速冷冻产生一层薄薄的玻璃态冰，防止冰晶形成。玻璃化仪器的进展，从手动投入装置到商业化的 Leica EM Grid 和 Thermo Fisher Vitrobot ，再到无吸滤的 chameleon 和 VitroJet 系统，不断改善着制样过程的一致性和可预测性。
2.4. 从块状样品制备薄片的技术
透射电子显微镜对软物质的观察通常受到样品厚度的限制，最佳厚度需要小于 300 nm。为了解决这个问题，可以使用聚焦离子束（FIB）铣削来局部减薄较厚的样品，产生 薄片 （lamellae），从而允许精确瞄准和提取特定区域和界面。对于对离子或电子束敏感、缺乏刚性、含有水或与镓有反应性的样品，室温下的 FIB 铣削并不合适。因此，冷冻兼容的减薄方法，如冷冻 FIB（cryo-FIB）得到发展。最近，冷冻 FIB 提取（cryo-FIB lift-out）技术展示了从高度敏感的块状晶体（如金属有机框架晶体和杂化卤化物钙钛矿单晶薄膜太阳能电池）中成功提取薄片的能力，突出了该技术在处理极端敏感材料和提供局部结构原子分辨率成像方面的巨大潜力。
3. 冷冻电镜的核心能力与仪器进展
3.1. 电子束损伤现象与辐射敏感材料成像策略
电子束损伤是冷冻电镜中根本的分辨率限制因素。对于低原子序数样品（如蛋白质、聚合物、有机框架），主要的损伤机制是辐解（电离），这源于非弹性散射。冷却样品到低温是减少电子显微镜中辐射损伤的主要方法。虽然低温并不能阻止第一次电离事件，但它通过固定辐解产物来减缓后续的化学损伤。
3.2. 电子显微镜中的低剂量成像
透射电镜中的剂量管理方法通常被称为低剂量成像。低剂量成像是冷冻电镜领域最重要的技术。在这种技术中，我们通过调整附近区域的成像条件（如聚焦、像散校正、对中操作）来最小化成像感兴趣区域（ROI）所需的剂量，并在 ROI 上拍摄最终图像。低剂量成像的演变极大地促进了包含有机成分的材料系统的检查。
3.3. 通过单颗粒分析进行高分辨率结构解析
单颗粒冷冻电镜通过结合来自不同方向的孤立大分子（称为单颗粒）的 TEM 图像来创建三维重构。为了获得高分辨率的 3D 重构，必须收集、对齐和平均数千张这样的图像。尽管传统上与生物系统相关，但冷冻电镜单颗粒分析最近已被应用于合成无机纳米材料的结构解析。
3.4. 冷冻电子断层扫描的三维成像
冷冻电子断层扫描（cryo-ET）与单颗粒分析在推导冷冻水合样品的三维可视化方面有相似之处。然而，cryo-ET 是通过从单个样品区域（称为 tilt series）收集一系列二维投影来实现这一点的，这是通过物理地倾斜样品台到各种角度来完成的。收集到的图像随后被计算组合成一个称为断层图的三维重构。
3.5. STEM 中的元素对比度和纳米级成像
扫描透射电子显微镜（STEM）是一种成熟的技术，用于在微观、纳米和原子尺度上表征材料。集成微分相位衬度 STEM（iDPC-STEM）是一种特定的 STEM 成像方法，可有效用于观察各种样品，包括重元素和轻元素，甚至氢。4D-STEM 使用会聚电子束在二维实空间中扫描样品，同时探测器在每个扫描点捕获二维倒易空间数据。
3.6. 原子级元素图谱：能量色散 X 射线光谱和电子能量损失谱
EDS 和 EELS 可以与冷冻电镜联用，以提供对敏感束材料（如软物质、聚合物、MOF、COF 和碳纳米结构）更全面的理解。EDS 和 EELS 都可用于绘制样品中元素的分布，这对于研究聚合物共混物中的相分离、识别碳纳米结构中的掺杂剂以及可视化软物质、COF 和 MOF 组装体中的元素分布非常有用。
3.7. 用于晶体和纳米结构样品的电子衍射技术
电子衍射（ED）是一种用于极高分辨率结构解析的强大技术，允许破译玻璃态下复合物的分子结构，这是任何其他方法都无法实现的。由于德布罗意理论，电子显微镜中加速的电子可以表现得像波一样，因此在穿过物质时会发生散射。像其他波粒现象一样，散射的电子也可以形成衍射图案，前提是散射物质具有有序结构。
4. 自动化、人工智能工具和开放数据在冷冻电镜工作流程中的作用
无论使用何种显微镜方法，最终都需要统计分析来提高信噪比。因此，该领域正朝着获取大型数据集的方向发展，这旨在实现系统性和可重复性，将电子显微镜推向真正的定量科学。最近，计算机科学，特别是计算机视觉的广泛发展，导致了更先进的计算方法的持续发展及其融入直观的软件工具中，显著提高了分析的准确性和便利性。
5. 冷冻电镜在软物质研究中的挑战、创新与未来
自动化的冷冻电镜已经彻底改变了结构生物学，但其在材料科学中的应用也越来越重要。虽然带有先进分析谱仪的 TEM 仍然是特定材料表征的宝贵工具，但一台单一的、自动化的、配备先进谱仪（如 EDS、EELS）的冷冻电镜将为广泛材料（聚合物、纳米颗粒、MOF、COF、碳纳米结构）和生物应用提供显著优势。
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