基于离子液体与羧酸修饰聚乙烯亚胺的DNA递送系统开发
摘要
重组DNA疫苗在疾病预防和治疗方面具有巨大潜力，但其临床应用常因免疫原性弱、细胞摄取率低、稳定性差及缺乏高效载体而受限。为解决这些问题，研究团队开发了一系列新型阳离子递送系统，通过将支化聚乙烯亚胺（PEI，25 kDa）用生物相容性羧酸（乳酸或乙醇酸）进行修饰，并引入胆碱基离子液体（胆碱乙醇酸盐CG和胆碱乳酸盐CL），形成先进的mPEI/离子液体（IL）配方。这些系统旨在增强DNA复合能力、抵抗酶降解、提高纳米颗粒稳定性，并优化理化性质以促进细胞相互作用。所形成的聚复合物可形成直径100–125 nm、表面电荷为+24至+29 mV的稳定纳米颗粒，支持高效的细胞摄取。与未修饰PEI相比，修饰后的配方显著降低了细胞毒性，并大幅提升了转染性能。在所有测试组合中，乳酸修饰PEI与胆碱乙醇酸盐（LA-mPEI + CG）的组合效果最佳，转染效率提升76%，细胞摄取提高66%，细胞存活率增强66%。这些发现突出了羧酸修饰PEI与离子液体结合的协同优势，为更安全、更高效的非病毒DNA递送提供了有前景的策略。
1. 引言
核酸疗法（包括DNA疫苗）为预防和治疗传染病及遗传性疾病提供了强大手段。然而，其临床应用常因递送相关挑战而受限，如低细胞摄取、易受酶降解及胞内运输效率低，导致转染效率低和免疫反应弱。病毒载体虽能实现高转染效率，但免疫原性、制备复杂性和成本问题促使人们转向更安全的非病毒递送系统。非病毒载体具有更好的安全性，但常在转染效率与生物相容性之间面临权衡。
聚乙烯亚胺（PEI）因其强DNA缩合能力和“质子海绵”效应（促进内体逃逸）而被广泛研究。然而，其实际应用受高细胞毒性（尤其是25 kDa高分子量形式）、聚集倾向和有限生物相容性制约。化学修饰（如乙酰化、PEG化和酰化）在降低细胞毒性和改善PEI基递送系统理化特性方面显示出潜力，但仍存在权衡。
羧酸修饰（使用乳酸或乙醇酸）可精细调控亲水性、聚合物构象及DNA结合-释放动力学，部分掩盖毒性阳离子位点，同时保持DNA缩合和内体逃逸能力。离子液体（ILs）提供了一种补充方法，通过动态调节表面电荷、纳米颗粒稳定性和细胞相互作用，改善DNA结合/释放动力学和胶体稳定性。胆碱基ILs（如CG和CL）因其优异生物相容性和调节表面电荷、水化及复合物稳定性的能力而备受关注。
本研究提出了一种体外概念验证，通过用乙醇酸或乳酸修饰支化PEI（25 kDa），并与胆碱基离子液体配方化，生成新型非病毒载体。通过纳米颗粒形成、表面电荷、细胞毒性、细胞摄取、内体逃逸和转染效率等体外实验评估这些配方，旨在探索聚合物修饰与离子液体结合对非病毒基因递送性能的影响。
2. 材料与方法
2.1 化学品与试剂
所有化学品和试剂均购自商业供应商。pcDNA™3.1/CT-GFP-TOPO®质粒购自Invitrogen。支化聚乙烯亚胺（PEI，25 kDa）、胆碱碳酸氢盐、乳酸、乙醇酸等购自Sigma-Aldrich。BHK-21细胞系购自ATCC。细胞培养试剂购自Thermo Fisher Scientific。Jet PEI®购自Polyplus。
2.2 PEI的羧酸修饰
通过将所选羧酸（乳酸或乙醇酸）与PEI在干燥二氯甲烷（DCM）中，以N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）为碱，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）为偶联剂，羟基苯并三唑（HOBt）为活化剂，进行48小时反应。反应后，通过快速滴加冷乙醚沉淀聚合物，离心收集，洗涤并真空干燥。最终产品通过透析和冻干纯化。
2.3 胆碱基离子液体的制备
将胆碱碳酸氢盐（80%水溶液）与乳酸或乙醇酸以1:2摩尔比在40°C混合，直至停止发泡，表明反应完全。混合物搅拌过夜，然后在60°C和10 mbar下旋转蒸发2小时去除水，最后在60°C真空烘箱中干燥72小时。
2.4 结构表征
2.4.1 核磁共振（NMR）分析
使用Bruker 400 MHz光谱仪记录改性PEI和离子液体的1H NMR谱。通过比较特征质子信号与PEI重复单元积分，计算取代度（DS）。GA-mPEI和LA-mPEI的DS分别为10%和11%。
2.4.2 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
使用Nicolet iS10光谱仪记录FTIR谱，确认改性PEI和离子液体的官能团。
2.5 理化性质表征
改性PEI和离子液体的水分含量、pH和Zeta电位通过标准方法测量。缓冲能力通过酸-碱滴定评估，LA-mPEI显示最高缓冲能力。
2.6 聚复合物配方与优化
2.6.1 质粒DNA转化与纯化
将pcDNA™3.1/CT-GFP-TOPO®质粒转化至Top10感受态大肠杆菌，通过菌落PCR和琼脂糖凝胶电泳验证，使用Qiagen® Miniprep Kit提取质粒DNA。
2.6.2 聚复合物配方
在无菌条件下，将质粒DNA与未修饰或改性PEI在0.9%氯化钠中混合。对于含离子液体的配方，将IL以15% w/v加入聚合物溶液。混合物室温孵育30分钟形成复合物。
2.6.3 聚复合物优化
通过凝胶阻滞实验确定最佳氮磷（N/P）比。在N/P比为4时实现完全DNA缩合，但选择N/P比为6以确保稳定性。
2.6.4 DNA完整性评估
通过肝素置换实验评估DNA完整性，显示所有配方中DNA保持完整。
2.7 DNase I保护实验
聚复合物与DNase I在37°C孵育不同时间，通过肝素处理释放DNA，琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整性。改性PEI配方提供更佳DNA保护。
2.8 聚复合物理化性质
使用动态光散射（DLS）测量聚复合物粒径、Zeta电位和多分散指数（PDI）。未修饰PEI形成最小颗粒（80.4 ± 1.8 nm）和最高Zeta电位（36.8 ± 4.9 mV），而改性PEI配方粒径增大（101–104 nm），Zeta电位降低。
2.9 体外细胞研究
2.9.1 细胞培养与维持
BHK-21细胞在DMEM中培养。猪单核来源的树突状样细胞（DC-like cells）从猪外周血单核细胞（PBMCs）生成，培养7天。
2.9.2 细胞毒性评估
使用MTT法评估细胞毒性。改性PEI配方显著提高细胞存活率，尤其是GA-mPEI + CL。
2.9.3 细胞摄取与胞内分布
通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估Alexa Fluor 647标记DNA的摄取。LA-mPEI + CG在BHK-21和DC-like细胞中均显示最高摄取效率和平均荧光强度。
2.9.4 内体逃逸动力学
通过活细胞共聚焦成像监测内体逃逸。LA-mPEI + CG和GA-mPEI + CL显示最快逃逸动力学。
2.9.5 转染效率测定
在BHK-21和DC-like细胞中评估eGFP表达。LA-mPEI + CG在有无血清条件下均显示最高转染效率（89–92%），显著优于未修饰PEI和Jet PEI®。
**3. 统计
