酶是一类具有高效催化能力的大分子生物分子，其催化效率远超化学催化剂，并且具有高特异性和温和反应条件等优点[1]、[2]、[3]。在工业应用中，酶被广泛应用于食品加工[4]、药物合成[5]、生物燃料生产[6]和环境修复[7]等领域。然而，游离酶对环境条件非常敏感[8]，高温、极端pH值或有机溶剂容易破坏其空间结构，导致不可逆失活[9]。此外，游离酶难以回收和重复使用[10]，这大大增加了生产成本，限制了其大规模应用[11]。此外，酶的研究和应用依赖于纯化酶[12]，这无疑带来了高昂的纯化成本[13]。固定化酶技术在一定程度上可以克服游离酶的局限性[14]。一方面，这种方法具有显著优势。固定化增强了酶结构的刚性，从而显著提高了其对变性的热稳定性和操作稳定性，并且便于将生物催化剂从反应混合物中分离出来，实现重复使用和连续操作，从而大幅降低了工业成本[15]。另一方面，固定化不可避免地引入了一些缺点。酶与载体之间的相互作用可能导致构象变化，从而阻塞活性位点，导致活性降低。因此，固定化技术不断发展，旨在最大化稳定性和可回收性的同时，尽量减少活性损失和扩散限制[16]、[17]、[18]。
物理固定化方法简单温和，但在极端条件下可能导致酶泄漏[19]，而化学固定化方法（例如共价交联）由于结合强度增强而更加稳定。交联酶聚集体（CLEAs）是一种简单高效的无需载体的固定化策略，其中酶分子沉淀成物理聚集体，然后通过双功能试剂（例如戊二醛或Genipin）进行交联，形成不溶性的生物催化剂[20]。这种方法保持了酶的高局部浓度，从而提高了催化性能。此外，交联网络内的限制效应有助于提高酶的稳定性[21]。然而，传统的CLEAs通常具有不规则的形态、宽的尺寸分布和较差的机械强度，导致破碎和处理和回收困难[22]。已经开发出了一些先进的策略来克服这些限制。例如，加入磁性纳米颗粒有助于分离和稳定性[23]、[24]；通过碳酸钙模板制备的酶微球提高了稳定性[25]。这些创新共同提高了CLEAs的可回收性和工业可行性。
多酶级联催化作为一种强大且高效的生物合成策略[26]，将多个酶促反应步骤整合到一个系统中，实现了中间体的即时转化。这有效防止了不稳定或有毒中间体的积累，显著提高了工艺安全性和整体效率[27]。然而，依赖于游离酶随机混合的传统多酶级联反应存在中间体扩散损失和转移效率低的问题，这限制了催化性能。为了解决这些问题，已经广泛开发了多酶共固定化策略。例如，Tsujimura等人报道了乳酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶在电极上的共固定化，通过级联反应生成多个电子[28]。Cao等人报道了甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶和酒精脱氢酶分别固定在水凝胶颗粒中，从CO2中生成甲醇[29]。Chen等人报道了Rhizomucor miehei脂肪酶作为CLEAs固定化，高效合成1,3-二油酰-2-棕榈酰甘油，用于婴儿配方[30]。通过调节空间组织、缩短酶间距离、构建底物通道和优化底物转移路径，这些策略大大提高了级联效率[31]。研究表明，这种模仿天然多酶复合物的自组装方法能够实现底物通道效应和协同催化机制，从而显著提高了各种代谢途径的效率[32]。这为高效酶催化系统的合理设计提供了重要方向。
胆绿素IXα（BV）是一种线性四吡咯化合物，通过血红素（heme）的降解产生[33]，这一过程由血红素加氧酶（HO）催化。BV因其抗炎和抗氧化特性而受到广泛关注，在器官移植、伤口愈合、病毒感染、阿尔茨海默病和糖尿病等领域显示出有益效果[34]。HO是一种主要存在于肝脏、脾脏和大脑等组织中的微粒体酶，其功能是催化血红素分子的α-甲基桥的氧化断裂。该反应是一个多步骤、能量依赖的过程，需要分子氧（O₂）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为辅因子，并依赖于NADPH-细胞色素P-450还原酶系统（NADPH-CPR）提供电子[35]。具体来说，HO首先与heme-Fe（III）结合形成酶-底物复合物，然后通过NADPH-CPR提供的电子还原为Fe（II）状态。随后，氧气与这个复合物结合，形成活性氧中间体，进一步氧化heme的α-甲基桥，生成α-甲基羟基血红素。这个中间体释放出一氧化碳（CO），形成胆绿素中间体。最后，在NADPH-CPR的持续电子供给和氧气的参与下，胆绿素中间体进一步裂解，释放出亚铁离子（Fe²⁺），最终生成BV[36]。在整个反应过程中，HO和NADPH-CPR形成一个级联系统，每个降解的血红素分子产生等量的BV、CO和Fe²⁺[37]。这一途径不仅对血红素代谢至关重要，也是体内抗氧化防御、抗炎反应和气体信号分子生成的关键机制。
氧化还原酶作为生物催化过程中的关键参与者，通常依赖于辅酶NAD(P)⁺或NAD(P)H的参与。然而，这些辅酶的高成本显著增加了反应费用，严重限制了氧化还原酶在大规模工业过程中的广泛应用[38]。因此，出现了辅酶再生技术。两种常用的NAD(P)H再生酶是葡萄糖脱氢酶（GDH）和甲酸脱氢酶[39]。GDH因其能够使用廉价的D-葡萄糖将NAD⁺还原为NADH，NADP⁺还原为NADPH而受到广泛关注[40]。
本研究利用重组血红素加氧酶（rHO）、重组细胞色素P450还原酶（rCPR）和重组葡萄糖脱氢酶（rGDH）构建了一个多酶级联反应。使用Genipin作为交联剂，胺化的磁性纳米颗粒（nano-Fe3O4-NH2）作为磁性核心，从细胞裂解物中直接一步固定了这些粗酶，制备出MCLEAs。所得的MCLEAs被用于通过级联反应生成BV。系统评估了各种参数的影响，包括温度和pH对酶活性、储存稳定性、重复使用性以及游离和固定化的rHO、rCPR和rGDH的动力学参数。
